锌指蛋白6(ZBED6)研究进展

锌指蛋白6(ZBED6)基因是新发现的一个转录调控因子,与肌肉的生长发育密切相关,可调控胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2)在内的多种基因的表达,为哺乳动物特有,序列高度保守。IGF2作为重要的生长调节因子,内含子3区域可与ZBED6结合,ZBED6的结合可抑制IGF2表达,进而调控细胞的增殖分化和肌肉的生长发育。总结了目前对ZBED6基因的生理功能研究进展,已有研究表明ZBED6可抑制IGF2的表达,促进骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏等器官的生长发育,降低脂肪沉积,体内蛋白质、脂质等生物大分子的代谢过程也随之发生变化,ZBED6在糖尿病、癌症的发展过程中均发挥着重要的调控作用。此外,还总结了影响ZBED6表达的多种因素,包括碱基突变、DNA甲基化、组蛋白修饰以及回文序列等。最后,展望了ZBED6的实际应用潜力,其作为一个与肌肉生长发育密切相关的转录因子,可通过敲除ZBED6促进肌肉生长,为瘦肉型动物的遗传育种提供了新的思路。

Zbed6基因敲除对小鼠骨骼肌生长发育的影响及其分子作用机制研究

【目的】研究锌指BED结构域包含蛋白6(ZBED6)基因敲除对青春期小鼠骨骼肌生长发育的影响及其分子作用机制。【方法】以8周龄野生型(WT)和Zbed6基因敲除(Zbed6^(-/-))C57BL/6小鼠为试验对象,采集血液,用ELISA法检测血清睾酮含量;分离骨骼肌组织并记录肌肉重、肌肉率。通过骨骼肌组织切片和免疫组化分析检测骨骼肌肌纤维面积及IGF2蛋白表达水平。通过Illumina NovaseqTM6000高通量测序对WT和Zbed6^(-/-)雌、雄小鼠进行转录组测序分析,联合小鼠ZBED6靶基因数据,筛选在Zbed6基因敲除小鼠肌肉组织中发挥作用的下游靶基因,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序结果中差异表达基因的可靠性。【结果】与WT小鼠相比,Zbed6^(-/-)雌、雄小鼠肌肉重、肌肉率均极显著增加(P<0.01)。Zbed6基因敲除后,雌、雄小鼠骨骼肌Zbed6基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),IGF2的mRNA及蛋白表达量均显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01),血清睾酮含量极显著升高(P<0.01)。转录组测序结果显示,Zbed6^(-/-)组雄鼠骨骼肌中共筛选到38个差异表达基因,其中22个上调,16个基因下调;雌鼠骨骼肌中筛选到49个差异表达基因,其中19个基因上调,30个基因下调。共有10个差异表达基因在雌、雄小鼠中共同表达,其中Dock3、Lhx2、Brsk2、Caskin1、Gbe1为ZBED6靶基因。实时荧光定量PCR检测发现,4个差异表达基因的表达情况与转录组测序分析结果一致,证实测序结果准确可信。【结论】Zbed6^(-/-)促进青春期小鼠骨骼肌生长发育,增加血清睾酮含量,筛选出Dock3、Lhx2、Brsk2、Caskin1、Gbe1 5个ZBED6靶基因。研究结果为深入探究ZBED6功能提供了新的基因靶点和研究方向,有助于完善ZBED6功能图谱,为大动物品种改良和畜禽瘦肉性状遗传育种研究提供了重要的理论依据。

GATA6 siRNA对肝癌HCC-9204细胞自噬和周期的影响及机制研究

目的:探讨锌指蛋白GATA6(GATA6)小分子干扰RNA(siRNA)对肝癌HCC-9204细胞自噬和周期的影响及机制。方法:肝癌HCC-9204细胞中转染GATA6 siRNA、siRNA control,定量即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)方法检测GATA6 mRNA表达;Western blot方法检测GATA6、卷曲螺旋状Myosin样Bcl-2相互作用蛋白(beclin1)、自噬相关基因3(ATG3)、磷酸化信号转导与转录因子3(p-STAT3)蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期。STAT3信号激活剂处理转染GATA6 siRNA后的肝癌HCC-9204细胞,用上述方法检测细胞周期和beclin1、ATG3、p-STAT3蛋白表达。结果:与转染siRNA control后的肝癌HCC-9204细胞比较,转染GATA6 siRNA可以降低细胞中GATA6 mRNA和蛋白表达量,提高细胞G0/G1期比例,减少细胞中beclin1、ATG3、p-STAT3蛋白表达。STAT3信号激活剂可以降低转染GATA6 siRNA后的肝癌HCC-9204细胞G0/G1期比例,提高细胞中beclin1、ATG3、p-STAT3蛋白表达水平。结论:GATA6 siRNA抑制肝癌HCC-9204细胞自噬并阻滞细胞周期,作用机制与降低STAT3信号通路激活水平有关。

miR-126对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的探讨miR-126表达水平对人晶状体上皮细胞系HLEB3凋亡的影响及作用机制。方法使用H2O2构建HLEB3体外凋亡模型,qRT-PCR检测miR-126水平变化;使用脂质体2000分别将miR-126模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)以及二者相应的阴性对照转染到HLEB3中,分别上调、下调细胞中miR-126表达,转染48 h后qRT-PCR验证转染效率,流式细胞仪检测各组HLEB3凋亡水平;通过靶基因预测软件预测miR-126可能靶向调控KLF6基因的表达,检测各组HLEB3中KLF6 mRNA和蛋白表达水平。结果 HLEB3凋亡模型中miR-126相对表达量明显高于正常HLEB3,差异有统计学意义(P<0.01)。模拟物组HLEB3凋亡率明显低于模拟物阴性对照组;抑制物组HLEB3凋亡率明显高于抑制物阴性对照组;差异均有统计学意义(均P<0.05)。模拟物组HLEB3中KLF6 mRNA相对表达量明显低于模拟物阴性对照组,抑制物组KLF6 mRNA相对表达量明显高于抑制物阴性对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);模拟物组HLEB3中KLF6蛋白相对表达量明显低于模拟物阴性对照组,抑制物组KLF6蛋白相对表达量明显高于抑制物阴性对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 miR-126在HLEB3凋亡模型中表达上调,miR-126可通过调控KLF6基因表达来影响HLEB3凋亡,在白内障发病机制中发挥作用。

姜黄素通过miR-181a调控KLF6表达抑制骨肉瘤细胞的生长

目的:探讨姜黄素通过微小RNA-181a(miR-181a)调控锌指蛋白Kruppel样因子6(KLF6)表达对骨肉瘤细胞生长的影响。方法:体外培养骨肉瘤细胞系U2OS细胞,将U2OS细胞分为对照组(不作处理)、姜黄素组(终浓度分别为5, 10, 20μmol/L姜黄素)、miR-181a阴性对照(miR-NC)组、miR-181a模拟物(miR-181a mimics)组、姜黄素(20μmol/L)+NC组、姜黄素(20μmol/L)+miR-181a mimics组,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法与平板克隆形成实验检测各组U2OS细胞增殖情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-181a与KLF6 mRNA表达情况;蛋白印迹分析法检测各组U2OS细胞KLF6、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin D1表达变化;双荧光素酶报告实验验证miR-181a与KLF6的靶向关系。结果:与对照组相比,随着姜黄素浓度升高,U2OS细胞存活率、细胞平板克隆形成率、Cyclin D1、Cyclin B1蛋白、miR-181a表达水平逐渐降低,KLF6表达水平逐渐升高,并呈浓度依赖性(P<0.05);经targetscan数据库预测显示,miR-181a与KLF6 mRNA 3’UTR区有结合位点,与KLF6-3’UTR-WT+miR-181a NC组比较,KLF6-3’UTR-WT+miR-181a mimics组荧光素酶活性降低(P<0.05);与对照组及miR-NC组相比,miR-181a mimics组U2OS细胞存活率、细胞平板克隆形成率、Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),KLF6蛋白表达水平显著降低(P<0.05);过表达miR-181a显著降低姜黄素对U2OS细胞增殖抑制作用。结论:姜黄素可抑制骨肉瘤细胞的生长,其作用可能是通过抑制miR-181a表达而调控KLF6表达实现。