GLIS家族锌指蛋白2(GLIS2)负调控Wnt/β-catenin通路抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的探究人类基因GLIS家族锌指蛋白2(GLIS2)对Wnt/β联蛋白(β-catenin)通路调控作用,及对人骨髓间充质干细胞(BMMSC)分化的影响。方法培养人BMMSC,随机分为空白组、成骨诱导组、腺病毒GLIS2基因过表达(ad-GLIS2)组、ad-GLIS2阴性对照、GLIS2基因敲低(si-GLIS2)组、si-GLIS2阴性对照(si-NC)组。反转录PCR检测GLIS2 mRNA表达判定转染情况,对硝基苯磷酸苯二钠(PNPP)法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色法检测钙化结节形成判定其成骨特性;T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)报告试剂盒检测细胞内Wnt/β-catenin通路激活情况;Western blot法检测GLIS2、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨桥蛋白(OPN)、成骨细胞特异性转录因子(osterix)表达。谷胱甘肽巯基转移酶沉降(GST-pulldown)实验验证GLIS2与β-catenin二者相互作用关系。结果与空白组相比,成骨诱导组BMMSC的ALP活性及钙化结节形成增强,Wnt/β-catenin通路活性及成骨分化相关蛋白表达升高,成骨形成能力增强,GLIS2表达降低。上调GLIS2表达后,抑制BMMSC成骨分化能力,抑制Wnt/β-catenin通路活性及成骨分化相关蛋白表达,反之下调GLIS2表达后,可促进BMMSC成骨分化能力,提高Wnt/β-catenin通路活性及成骨分化相关蛋白表达。β-catenin与GLIS2之间有相互作用关系。结论GLIS2可能通过负调控Wnt/β-catenin通路活化,抑制BMMSC成骨分化能力。

锌指蛋白GLi在肝细胞癌的发生、发展及治疗中的研究进展

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率一直居高不下。目前肝细胞癌的首选治疗方法为手术治疗及肝移植,但5年生存率仍较低,且由于肝细胞癌起病隐匿,大多数患者初期均无特殊表现,确诊时已经处于终末期,失去手术机会。Hh通路在肿瘤的发生、发展中发挥关键作用,锌指蛋白GLi作为Hh通路中的关键转录因子在肿瘤的发生中起着重要作用。同时锌指蛋白GLi可通过诱导上皮-间质转化的发生,从而在肝细胞癌的侵袭转移过程中发挥关键作用。此外锌指蛋白GLi还与多种肿瘤相关因子相互作用从而影响肝细胞癌的发生、发展。本文就锌指蛋白GLi在肝细胞癌发生、发展及治疗中的作用作一综述。

肉桂醛调节Shh/Gli1信号通路对幽门螺旋杆菌胃炎大鼠胃黏膜损伤的影响

目的 探讨肉桂醛调节音猬因子(Shh)/Gli家族锌指蛋白1(Gli1)信号通路对幽门螺旋杆菌(Hp)胃炎大鼠胃黏膜损伤的影响。方法 将大鼠随机分为对照组、模型组、肉桂醛低剂量组、肉桂醛中剂量组、肉桂醛高剂量组、替普瑞酮组、肉桂醛高剂量+Shh激活剂Purmorphamine(PUR)组,每组18只。通过灌胃Hp的方法构建胃炎大鼠模型。建模成功后,肉桂醛低、中、高剂量组大鼠分别灌胃12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg肉桂醛,替普瑞酮组大鼠灌胃0.13 g/kg替普瑞酮,肉桂醛高剂量+PUR组大鼠给予50 mg/kg肉桂醛灌胃和6.67 mg/kg PUR腹腔注射,每天给药1次,持续2周。HE染色检测大鼠胃黏膜组织病理变化;透射电镜观察大鼠胃黏膜细胞形态。将GES-1细胞分为vitro-对照组、vitro-模型组、vitro-肉桂醛低剂量组、vitro-肉桂醛中剂量组、vitro-肉桂醛高剂量组、vitro-替普瑞酮组、vitro-肉桂醛高剂量+PUR组。除vitro-对照组外,其他组GES-1细胞均需被Hp感染,感染结束后,vitro-肉桂醛低剂量组、vitro-肉桂醛中剂量组、vitro-肉桂醛高剂量组分别用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L肉桂醛处理24 h;vitro-替普瑞酮组用1μmol/L替普瑞酮处理24 h;vitro-肉桂醛高剂量+PUR组用20μmol/L肉桂醛和1μmol/L PUR共同处理24 h,CCK-8法检测GES-1细胞增殖抑制率;ELISA法检测大鼠胃黏膜组织及GES-1细胞上清中白细胞介素1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot检测大鼠胃黏膜组织及GES-1细胞中Shh、Gli1蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠胃黏膜组织病理损伤严重,胃黏膜表面上皮细胞固缩,细胞膜破损,IL-1β、TNF-α水平及Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,肉桂醛低剂量组、肉桂醛中剂量组、肉桂醛高剂量组、替普瑞酮组大鼠胃黏膜组织病理损伤、胃黏膜表面上皮细胞结构及形态有所改善,IL-1β、TNF-α水平及Shh、Gli1蛋白表达降低(P<0.05);与肉桂醛高剂量组比较,肉桂醛高剂量+PUR组大鼠胃黏膜组织病理损伤加剧,胃黏膜表面上皮细胞结构及形态破环严重,IL-1β、TNF-α水平及Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05)。与vitro-对照组比较,vitro-模型组GES-1细胞增殖抑制率、细胞上清中IL-1β、TNF-α水平及细胞中Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05);与vitro-模型组比较,vitro-肉桂醛低剂量组、vitro-肉桂醛中剂量组、vitro-肉桂醛高剂量组、vitro-替普瑞酮组GES-1细胞增殖抑制率、细胞上清中IL-1β、TNF-α水平及细胞中Shh、Gli1蛋白表达降低(P<0.05);与vitro-肉桂醛高剂量组比较,vitro-肉桂醛高剂量+PUR组GES-1细胞增殖抑制率、细胞上清中IL-1β、TNF-α水平及细胞中Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05)。结论 肉桂醛可能通过抑制Shh/Gli1通路减轻Hp诱导的胃炎大鼠胃黏膜损伤。

整联蛋白α5β1通过介导Gli1表达影响基底细胞癌的生长与放疗敏感性

目的探讨整联蛋白α5β1对基底细胞癌(BCC)生长和放疗敏感性的影响及分子机制。方法采用免疫组织化学染色检测皮肤BCC组织及正常皮肤组织中α5β1的表达差异。将A431细胞随机分为对照A组(细胞正常培养)、pLEX-MCS组(采用含pLEX-MCS的慢病毒转染细胞)、pLEX-α5β1组(采用含pLEX-α5β1的慢病毒转染细胞)、pLEX-α5β1+Gli家族锌指蛋白1(Gli1)抑制剂组(采用含pLEX-α5β1的慢病毒转染细胞,并添加100μmol/L Gli1抑制剂GANT61处理细胞)。采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测细胞内α5β1与Gli1的表达情况;采用MTT法和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色检测细胞增殖能力;通过Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态;采用Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力。再将A431细胞随机分为对照B组(细胞正常培养)、4 Gy组(采用4 Gy X射线照射细胞)、pLEX-α5β1+4 Gy组(采用含pLEX-α5β1的慢病毒转染细胞,再用4 Gy X射线照射细胞),采用MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果α5β1在皮肤BCC组织中的阳性表达率高于正常皮肤组织(P<0.05)。与对照A组和pLEX-MCS组比较,pLEX-α5β1组细胞中α5β1和Gli1 mRNA和蛋白表达水平均升高,细胞存活率升高,EdU阳性细胞率升高,迁移细胞数与侵袭细胞数均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与pLEX-α5β1组比较,pLEX-α5β1+Gli1抑制剂组细胞中Gli1 mRNA和蛋白表达水平均下降,细胞存活率降低,EdU阳性细胞率降低,迁移细胞数与侵袭细胞数也均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。在处理后培养24、48和72 h时,与对照B组比较,4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P<0.05);pLEX-α5β1+4 Gy组细胞增殖活性较4 Gy组明显升高(P<0.05)。4 Gy组细胞凋亡率较对照B组明显升高(P<0.05);pLEX-α5β1+4 Gy组细胞凋亡率较4 Gy组明显降低(P<0.05)。结论α5β1在BCC组织中高表达,能够促进BCC细胞增殖、迁移及侵袭,抑制细胞凋亡,并降低细胞的放疗敏感性,该作用可能与调控Gli1表达有关。

NSCLC癌组织中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况与淋巴结转移和预后的相关性

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织中双肾上腺素样激酶1(DCLK1)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和GLI家族锌指蛋白3(GLI3)表达情况与其淋巴结转移和预后的相关性。方法以2016年2月至2017年3月该院诊治的NSCLC患者60例作为研究对象,均予以安罗替尼靶向治疗3个月后随访3年,根据患者是否死亡将其分为死亡组和生存组,所有患者均进行肺部活检,取患者的癌组织以及癌旁组织,比较癌组织以及癌旁组织DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况的差异;比较不同病理状态、不同预后的患者癌组织DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况的差异,分析不良预后以及肿瘤淋巴结转移与癌组织中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达的相关性。结果癌组织的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于癌旁组织,DCLK1蛋白的高表达比例显著低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、TNM分期患者癌组织中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况的差异均无统计学意义(P>0.05);腺癌患者癌组织中的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于鳞癌患者,DCLK1蛋白高表达比例显著低于鳞癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05);有淋巴结转移的患者癌组织中的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于无淋巴结转移的患者,DCLK1蛋白高表达比例显著低于无淋巴结转移的患者,差异均有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示,NSCLC的淋巴结转移以及不良预后分别与癌组织中Caspase-3(r=0.459、0.767,P<0.05)和GLI3蛋白表达(r=0.334、0.456,P<0.05)呈正相关,与DCLK1蛋白表达呈负相关(r=-0.553、-0.877,P<0.05)。结论NSCLC的淋巴结转移以及不良预后分别与癌组织中Caspase-3和GLI3蛋白表达呈正相关,与DCLK1蛋白表达呈负相关,可指导NSCLC的临床诊断。

冬凌草甲素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响及其机制

目的探讨冬凌草甲素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响及其机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、模型组、冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、戊酸雌二醇组、冬凌草甲素高剂量+环巴胺组,每组12只。X射线检测评估大鼠骨折愈合情况;ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;三点弯曲实验检测股骨最大载荷和最大位移;双能X线骨密度扫描仪检测股骨骨密度;HE-阿尔新蓝染色检测骨痂组织病理变化;Western blot检测碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、Shh、Gli1蛋白表达。结果与对照组比较,模型组骨小梁结构紊乱,骨折线清晰,血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05),股骨最大载荷、最大位移、骨密度及ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组骨小梁排列较密集,骨折线模糊不清,血清中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05),股骨最大载荷、最大位移、骨密度及ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表达升高(P<0.05);与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组骨小梁结构疏松,骨折线较清晰,血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05),股骨最大载荷、最大位移、骨密度及ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表达降低(P<0.05)。结论冬凌草甲素可能通过激活声波刺猬(Shh)/Gli家族锌指蛋白1(Gli1)信号通路促进骨质疏松大鼠骨折愈合。

5-氟尿嘧啶对结肠癌大鼠增殖细胞核抗原表达及端粒酶活性的影响

目的探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)对结肠癌大鼠增殖细胞核抗原(PCNA)表达及端粒酶(hTRT)活性的影响。方法取无特殊病原菌级标准健康雄性裸大鼠36只,10周龄,体重200~230 g。配制结肠癌细胞LoVo单细胞悬液腹腔注射建立结肠癌大鼠模型。将建模成功的30只结肠癌大鼠随机平分为3组-模型组、5-氟尿嘧啶1组、5-氟尿嘧啶2组,模型组予以0.3 mL 0.9%氯化钠溶液灌胃治疗;5-氟尿嘧啶1组、5-氟尿嘧啶2组给予腹腔注射5-氟尿嘧啶,剂量分别为30、60 mg/kg,1次/d,1周3次,共应用4周。测定与记录3组大鼠治疗第2周与第4周的肿瘤体积。观察与记录3组大鼠治疗第4周的结肠癌转移情况,包括局部淋巴结转移、肝转移、肺转移、腹膜转移等。采用免疫组织化学法检测平均单个视野下PCNA阳性细胞、hTRT阳性细胞比率。蛋白质印迹法检测GLI家族锌指蛋白1(Gli1)蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的相对表达水平。结果5-氟尿嘧啶1组、5-氟尿嘧啶2组治疗第2周与第4周的肿瘤体积均低于模型组(P<0.05),5-氟尿嘧啶2组低于5-氟尿嘧啶1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5-氟尿嘧啶1组、5-氟尿嘧啶2组治疗第4周的结肠癌局部淋巴结转移、肝转移、肺转移、腹膜转移率均低于模型组(P<0.05),5-氟尿嘧啶2组低于5-氟尿嘧啶1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5-氟尿嘧啶1组、5-氟尿嘧啶2组治疗第4周的PCNA、hTRT阳性细胞比率和Gli1、VEGF蛋白相对表达水平均低于模型组(P<0.05),5-氟尿嘧啶2组低于5-氟尿嘧啶1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论5-氟尿嘧啶在结肠癌大鼠的应用具有很好的抑瘤效果,也可降低周围组织转移率,可抑制Gli1、VEGF蛋白的表达,其作用机制与抑制PCNA表达及hTRT活性具有相关性。

GLI1及Shh在卵巢型子宫内膜异位症恶变过程中的表达及其意义

目的探讨神经胶质瘤相关基因同源蛋白1(GLI1)及超音刺猬蛋白(Shh)在卵巢型子宫内膜异位症(EM)恶变过程中的表达及其临床意义。方法收集2000年4月—2018年4月在青岛大学附属医院及山东省威海市立医院行手术治疗的EM相关性卵巢上皮性癌(EAOC,即卵巢型EM恶变)患者50例(EAOC组),其年龄为(49±7)岁;另收集同期的卵巢异位子宫内膜非典型增生(aEM)患者35例(aEM组),其年龄为(44±9)岁,卵巢型EM患者50例(EM组),其年龄为(37±8)岁。实时荧光定量PCR技术及免疫组化EnVision二步法分别检测3组病变组织中GLI1、Shh mRNA和蛋白的表达,比较其在卵巢型EM恶变过程中的表达差异,分析GLI1与Shh表达的相关性,并分析GLI1及Shh表达与EAOC患者临床病理特征、预后的关系。结果(1)实时荧光定量PCR技术检测显示,EM组、aEM组、EAOC组病变组织中GLI1 mRNA的表达水平分别为1.77±0.40、3.54±0.44、7.80±0.24,Shh mRNA的表达水平分别为0.95±0.21、3.14±0.35、5.41±0.31,EAOC组GLI1、Shh mRNA的表达水平均显著高于EM组、aEM组(P均<0.01),EM组与aEM组分别比较,差异也均有统计学意义(P均<0.01)。免疫组化EnVision二步法检测显示,EM组、aEM组、EAOC组病变组织中,GLI1蛋白的高表达率分别为32%(16/50)、57%(20/35)及66%(33/50),Shh蛋白的高表达率分别为20%(10/50)、49%(17/35)、54%(27/50),3组分别比较,差异均有统计学意义(P均<0.01)。EAOC组织中,GLI1 mRNA与Shh mRNA的表达呈显著正相关(r=0.721,P<0.01),GLI1蛋白与Shh蛋白的表达也呈显著正相关(r=0.608,P=0.001)。(2)GLI1蛋白表达与EAOC患者的血清癌抗原125(CA125)水平、国际妇产科联盟(FIGO)分期、淋巴结转移状态、铂敏感性显著有关(P均<0.05);Shh蛋白表达与EAOC患者的FIGO分期、淋巴结转移状态均显著有关(P均<0.05)。logistic回归模型多因素分析显示,FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期、血清CA_(125)≥35 kU/L、GLI1蛋白高表达是影响EAOC患者预后的独立因素(P均<0.05)。Kaplan-Meier法生存分析显示,在EAOC患者中,GLI1蛋白高表达、低表达患者的5年总生存率分别为12.1%、35.3%,两者比较,差异有统计学意义(χ^(2)=10.73,P<0.01);Shh蛋白高表达、低表达患者的5年总生存率为11.1%、30.4%,两者比较,差异有统计学意义(χ^(2)=3.96,P=0.047)。结论GLI1及Shh均与卵巢型EM恶变相关,两者在促进卵巢型EM恶变方面可能有一定的作用,GLI1及Shh蛋白高表达提示EAOC患者的预后不良。