Zbed6基因敲除对小鼠骨骼肌生长发育的影响及其分子作用机制研究

【目的】研究锌指BED结构域包含蛋白6(ZBED6)基因敲除对青春期小鼠骨骼肌生长发育的影响及其分子作用机制。【方法】以8周龄野生型(WT)和Zbed6基因敲除(Zbed6^(-/-))C57BL/6小鼠为试验对象,采集血液,用ELISA法检测血清睾酮含量;分离骨骼肌组织并记录肌肉重、肌肉率。通过骨骼肌组织切片和免疫组化分析检测骨骼肌肌纤维面积及IGF2蛋白表达水平。通过Illumina NovaseqTM6000高通量测序对WT和Zbed6^(-/-)雌、雄小鼠进行转录组测序分析,联合小鼠ZBED6靶基因数据,筛选在Zbed6基因敲除小鼠肌肉组织中发挥作用的下游靶基因,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序结果中差异表达基因的可靠性。【结果】与WT小鼠相比,Zbed6^(-/-)雌、雄小鼠肌肉重、肌肉率均极显著增加(P<0.01)。Zbed6基因敲除后,雌、雄小鼠骨骼肌Zbed6基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),IGF2的mRNA及蛋白表达量均显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01),血清睾酮含量极显著升高(P<0.01)。转录组测序结果显示,Zbed6^(-/-)组雄鼠骨骼肌中共筛选到38个差异表达基因,其中22个上调,16个基因下调;雌鼠骨骼肌中筛选到49个差异表达基因,其中19个基因上调,30个基因下调。共有10个差异表达基因在雌、雄小鼠中共同表达,其中Dock3、Lhx2、Brsk2、Caskin1、Gbe1为ZBED6靶基因。实时荧光定量PCR检测发现,4个差异表达基因的表达情况与转录组测序分析结果一致,证实测序结果准确可信。【结论】Zbed6^(-/-)促进青春期小鼠骨骼肌生长发育,增加血清睾酮含量,筛选出Dock3、Lhx2、Brsk2、Caskin1、Gbe1 5个ZBED6靶基因。研究结果为深入探究ZBED6功能提供了新的基因靶点和研究方向,有助于完善ZBED6功能图谱,为大动物品种改良和畜禽瘦肉性状遗传育种研究提供了重要的理论依据。

小鼠BTB/锌指结构新基因Bsg6的克隆及表达谱分析

Bsg6(brain specific gene 6)是用消减差异筛选的方法克隆的小鼠头部特异表达新基因.Bsg6基因cDNA长3 871 bp,编码一个670个氨基酸残基的蛋白,GenBank登录号AY635051,位于小鼠第4号染色体,由2个外显子构成.Bsg6蛋白含有一个N端BTB(Broad-complex,Tramtrack,andBric-a-brac)结构域和两个C端C2H2型锌指结构域.小鼠Bsg6蛋白与其在人类和鸡中同源蛋白的同源性分别为86.2%和79.1%.Bsg6在小鼠胚胎中的表达具有一定动态性,在E8.5的小鼠胚胎中,Bsg6主要在前脑和神经管表达.在E9.5的小鼠胚胎中,Bsg6的表达明显增强并主要集中在前脑的端脑部.Bsg6在E10.5小鼠胚胎端脑的表达出现了下降,但是在中脑和后脑的表达增加,此外,Bsg6 mRNA的表达还出现在肢芽和尾部.在HH10期的鸡胚中,Bsg6主要在头部和神经管前端表达.Northern杂交结果显示,Bsg6在很多小鼠成体组织中没有表达,但是在破骨细胞瘤中高表达.Bsg6的表达谱提示,Bsg6可能是在器官形成期对脑的发育起到重要作用的转录因子,而且其表达受到严格的调控,此外Bsg6还可能与肿瘤的发生有关.

高低级别胶质瘤中包含Jumonji C结构域蛋白6表达的差异及其与预后的关系

目的:探讨包含Jumonji C结构域蛋白6(JMJD6)在高低级别胶质瘤中表达的差异及其与胶质瘤预后的关系。方法:从2018年1月至2020年12月广东省人民医院神经外科收治的胶质瘤患者中随机抽取42例肿瘤标本,分为低级别组和高级别组,其中,低级别18例、高级别24例;用免疫组织化学法检测两组JMJD6的表达并采用t检验和χ^(2)检验比较两组JMJD6表达水平的差异;随访患者术后肿瘤复发及患者死亡,按JMJD6表达水平(去除阴性病例),分为低JMJD6表达组和高JMJD6表达组,随访40个月,采用χ^(2)检验、Kaplan-Meier曲线和Pearson相关分析JMJD6表达水平与预后的关系。结果:低级别组JMJD6的表达呈阴性7例、低表达9例、高表达2例;高级别组阴性0例、低表达9例、高表达15例;低级别胶质瘤JMJD6表达水平(2.06±2.88)与高级别胶质瘤JMJD6表达水平(7.88±1.90)比较,差异有统计学意义(t=-7.449,P<0.01)。低JMJD6表达组18例,高JMJD6表达组17例;低JMJD6表达组复发7例,复发率38.89%,死亡病6例,死亡率33.33%;高JMJD6表达组复发14例,复发率82.35%,死亡13例,死亡率76.47%;两组复发率及死亡率比较,差异均有统计学意义(χ^(2)=6.882,P<0.01和χ^(2)=6.556,P<0.05);JMJD6的表达水平与复发率及死亡率呈正相关(r=0.626、0.659,P<0.001);与低JMJD6表达组比较,高JMJD6表达组的患者生存时间更短(χ^(2)=7.631,P<0.01)。结论:胶质瘤级别越高,JMJD6表达水平也越高,JMJD6表达水平越高,肿瘤越易复发,患者预后越差,JMJD6有助于预测肿瘤复发及预后。

罗氟司特对大鼠创伤性脑损伤的作用及其机制研究

目的探讨罗氟司特(RF)对大鼠创伤性脑损伤(TBI)的作用及其可能的机制。方法按随机数字表法将36只大鼠分为3组:假手术(Sham)组、TBI组、TBI+RF组,每组12只。采用改良Feeney自由落体法建立大鼠TBI模型,TBI+RF组于建模后即刻、1 d、2 d时腹腔注射RF,Sham组和TBI组则予以等量溶剂。建模后1、2、3、7、14 d时对各组大鼠进行改良神经功能缺损严重程度评分(mNSS)。建模后3 d时,HE染色后观察病灶周围皮层神经元病理变化并分析死亡神经元数量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠损伤侧皮层白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量,免疫组化检测大鼠病灶周围皮层NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)含量。结果与TBI组比较,TBI+RF组的mNSS在建模后3 d内差异无统计学意义,但7 d、14 d时降低(P<0.05)。与Sham组比较,TBI组病灶周围脑组织结构疏松,细胞间质水肿明显,见较多死亡神经元(P<0.05);TBI+RF组病灶周围仍可见细胞间质水肿,但死亡神经元百分比较TBI组减少(P<0.05)。与Sham组比较,TBI组的IL-1β、IL-6、TNF-α和NLRP3含量均升高(P<0.05);而经罗氟司特治疗后,大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α和NLRP3含量均降低(P<0.05)。结论罗氟司特可能通过降低创伤性脑损伤早期的炎症介质水平,减轻大鼠创伤性脑损伤,从而起到神经保护作用。

ZC3H13和m6a甲基转移酶WTAP在结肠癌中的表达水平及与预后的关系

目的探讨锌指含CCCH结构域蛋白13(ZC3H13)、N6-甲基腺苷(m6a)甲基转移酶肾母细胞瘤1相关蛋白(WTAP)在结肠癌患者组织中的表达情况及与患者预后的关系。方法选取2017年1月-2019年6月在芜湖市中医医院手术治疗的结肠癌患者80例为研究对象,并在术中收集患者癌组织标本及癌旁组织标本,采用免疫组织化学染色法观察结肠癌组织中ZC3H13、WTAP表达情况,Western blot法检测组织中ZC3H13、WTAP表达水平;收集患者临床病理参数并对患者进行3年随访,Pearson法分析ZC3H13与WTAP表达的相关性;利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线;采用多因素Cox回归风险模型分析结肠癌患者的预后影响因素。结果结肠癌患者癌组织WTAP表达水平高于癌旁组织[(1.66±0.23)vs.(0.58±0.17)],ZC3H13表达水平低于癌旁组织[(0.45±0.09)vs.(1.04±0.22)],差异均有统计学意义(t=33.775、22.201,P均<0.05);结肠癌组织中ZC3H13和WTAP的表达水平成负相关(r=-0.615,P<0.05);结肠癌组织中ZC3H13、WTAP蛋白表达与远处转移、临床分期、分化程度、浸润深度有关(P<0.05);Kaplan-Meier分析结果显示,WTAP阳性表达患者3年累积生存率48.33%(29/60)显著低于阴性表达80.00%(16/20),差异有统计学意义(Log rankχ^(2)=6.219,P=0.013);ZC3H13阳性表达患者3年累积生存率83.33%(15/18)显著高于阴性表达患者48.39%(30/62),差异有统计学意义(Log rankχ^(2)=6.697,P=0.010);多因素Cox回归分析结果显示WTAP阳性、ZC3H13阴性、年龄(>60岁)、淋巴结转移(N2)、远处转移、临床分期(Ⅲ+Ⅳ)、浸润深度(T3+T4)均是影响患者预后的危险因素(P<0.05)。结论ZC3H13在结肠癌患者癌组织中表达降低,WTAP表达升高,二者表达水平与结肠癌患者临床特征及预后关系密切。