锌指E盒结合同源框2在人牙髓组织和细胞的表达

目的:检测锌指E盒结合同源框2(ZEB2)在人牙髓组织和细胞中的表达,并初步探讨其意义。方法:制作牙髓组织石蜡切片,荧光原位杂交技术(FISH)检测ZEB2的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测正常及TGF-β1刺激下人牙髓细胞(hDPCs)中ZEB2 mRNA表达水平;制作hDPCs细胞爬片,FISH检测ZEB2的表达。结果:FISH结果显示ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,在牙髓细胞呈弱阳性表达。RT-qPCR结果显示TGF-β1的作用促进ZEB2的表达,且具有浓度和时间依赖性,5ng/ml TGF-β1刺激ZEB2表达达最大(P<0.05);5ng/ml TGF-β1刺激后,ZEB2 mRNA在24h内表达逐渐上调,24h达峰值(P<0.05)。FISH结果示ZEB2在正常hDPCs胞质和胞核均呈弱阳性表达,TGF-β1刺激24h后ZEB2表达增强,胞核表达明显。结论:ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,正常hDPCs中弱阳性表达,而TGF-β1可促进hDPCs中ZEB2表达,提示ZEB2可能通过参与TGF-β1信号通路调控hDPCs的成牙本质向分化过程。

铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化

【目的】探讨铁皮石斛多糖(DOP)对CCl4诱导肝纤维化(HF)的影响及其作用机制。【方法】将56只雄性SD大鼠随机分为七组:正常组(NG)、模型组(MG)、秋水仙碱组(CG,0.1mg/kg)、扶正化瘀组(FG,0.45g/kg)、低剂量DOP组(LDG,0.05 g/kg)、中剂量DOP组(MDG,0.1 g/kg)和高剂量DOP组(HDG,0.2 g/kg),每组8只。采用皮下注射40%CCl4橄榄油混合液制备HF大鼠模型,每3 d注射1次,共10周。造模第6周结束后,各药物组分别给予秋水仙碱、扶正化瘀和DOP溶液灌胃处理,NG和MG大鼠给予等量0.9%生理盐水处理,每天1次,连续4周。各组大鼠肝组织病理学采用苏木精-伊红(HE)、Masson染色、天狼星红(Sirius red)染色检测;肝功能和肝纤四项指标采用血液生化法检测;肝组织中α-SMA、Col-I、E-cadherin、ZEB1基因和蛋白的表达分别采用RT-qPCR法和Western Blot法检测。【结果】HE、Masson、Sirius red染色结果显示MG大鼠肝脏组织出现典型的HF病理特征,LDG、MDG和HDG大鼠HF均出现不同程度改善。肝功能检测结果显示,LDG、MDG、HDG大鼠的血清AST、TBIL、AKP水平与MG相比均显著降低(P<0.05或<0.01),血清ALT水平除LDG外均显著降低(P<0.05或<0.01)。肝纤四项指标检测结果显示,LDG、MDG、HDG大鼠的血清HA、LN、PC-Ⅲ、COL-Ⅳ含量与MG比较均明显下降(P<0.05或<0.01)。基因、蛋白检测结果显示,LDG、MDG、HDG大鼠肝组织中α-SMA、COL-I、ZEB1的相对表达量明显降低(P<0.05或<0.01),而E-cadherin的相对表达量升高(P<0.05或<0.01)。此外,HA、α-SMA、COL-I、ZEB1、E-cadherin的表达均存在一定的DOP剂量依赖性。【结论】DOP可通过抑制大鼠肝组织的上皮-间质转化减轻CCl4诱导的HF程度。

沉默ZEB1基因对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的影响

目的:探讨沉默锌指E盒结合同源框1(ZEB1)基因对胶质瘤U87细胞间质标志物表达和细胞迁移的作用,阐明ZEB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:将构建的ZEB1短发夹RNA(shRNA)干扰质粒(shZEB1#1和shZEB1#2)和对照质粒(shCtrl)转染至胶质瘤U87细胞,Westernblotting法检测干扰效果。将胶质瘤U87细胞分为对照组(转染shCtrl的胶质瘤U87细胞)、EMT组[转染shCtrl的胶质瘤U87细胞用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导EMT]和ZEB1基因沉默组(转染shZEB1的胶质瘤U87细胞用TGF-β1诱导EMT)。Westernblotting法检测各组细胞中间质标志物(N-钙黏蛋白和波形蛋白)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的蛋白表达水平,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移率。结果:Westernblotting法检测,转染shZEB1#1和shZEB1#2的胶质瘤U87细胞中ZEB1蛋白表达水平较转染shCtrl的细胞明显降低(P<0.05或P<0.01),shZEB1#2对ZEB1表达的抑制效果更明显,表明ZEB1已稳定转染到U87细胞。与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞中N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01);与EMT组比较,ZEB1基因沉默组N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。EMT组细胞迁移率明显高于对照组(P<0.01),而ZEB1基因沉默组细胞迁移率明显低于EMT组(P<0.01)。结论:沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT,并降低细胞迁移能力,提示ZEB1可作为侵袭性胶质瘤治疗的重要靶标。

miR-128、ZEB1对子宫内膜癌细胞迁移侵袭和上皮间质转化的影响及其靶向关系验证

目的观察miR-128、ZEB1对子宫内膜癌(EC)细胞迁移侵袭和上皮间质转化的影响,并验证其二者之间的靶向关系。方法采用qRT-PCR和Western blotting法分别检测3种EC细胞系(HEC-1A、Ishikawa、KLE)及1种子宫内膜上皮细胞系hEEC中miR-128和ZEB1。以miR-128表达水平最低的Ishikawa细胞系作为后续研究对象,将Ishikawa细胞分为miR-128过表达组和阴性对照组,分别转染miR-128 mimics和miRNA-NC,48 h后收集细胞进行后续实验。细胞划痕实验和Transwell实验检测转染后各组细胞迁移和侵袭能力,Western blotting法检测转染后各组细胞ZEB1、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin等蛋白。双荧光素酶报告基因实验验证miR-128与ZEB1的靶向调控关系。结果与hEEC相比,EC细胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE中miR-128表达降低(P均<0.05),ZEB1蛋白表达升高(P均<0.05)。转染后,Ishikawa细胞中miR-128的表达明显升高(P<0.05),穿膜细胞数目及划痕愈合率均降低(P均<0.05),ZEB1、Fibronectin、Vimentin蛋白的相对表达量均降低(P均<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-128能够靶向调控ZEB1基因(P<0.05)。结论miR-128可以抑制Ishikawa细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化,ZEB1可促进Ishikawa细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化,miR-128与ZEB1具有靶向调控关系。

miR-181a调控小胶质细胞ZEB1对缺血性脑卒中模型炎症反应机制的影响

目的观察缺血性脑卒中(CIS)模型大鼠炎症反应及大脑皮层组织微小RNA(miR)-181a和锌指E盒结合同源框(ZEB)1蛋白水平变化情况,探讨miR-181a调控ZEB1对炎症反应的作用机制。方法将36只SD大鼠随机分为对照组、假伤组和模型组,雌雄各半,每组12只。模型组建立CIS模型,假伤组行假伤手术,对照组不做任何干预。取小胶质细胞(BV2)培养,分别转染miRNA Negtive Control(空白对照组)、miR-181a inhibitor(抑制表达组)和hsa-miR-181a(促进表达组)。采用免疫比浊法检测大鼠血清C反应蛋白(CRP)表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平。RT-PCR检测大鼠大脑皮层组织和转染细胞miR-181a和ZEB1 mRNA表达量,Western印迹检测大脑皮层组织和转染细胞ZEB1表达量。结果与对照组比较,假伤组和模型组超敏(hs)-CPR、IL-6和TNF-α表达水平均明显升高(均P<0.05);且模型组均明显高于假伤组(均P<0.05)。与对照组和假伤组比较,模型组miR-181a、ZEB1蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(均P<0.05)。模型组血清hs-CPR、IL-6和TNF-α表达与miR-181a相对表达量呈正相关,与ZEB1蛋白及mRNA相对表达量呈负相关(P<0.05,P<0.001)。与空白对照组比较,抑制表达组转染细胞miR-181a相对表达量明显下降,ZEB1蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(均P<0.05);促进表达组miR-181a相对表达量明显升高,ZEB1蛋白及mRNA相对表达量均明显下降(均P<0.05)。结论miR-181a可能通过调控小胶质细胞ZEB1表达而影响CIS模型炎症反应。

ZEB1与卵巢上皮癌化疗耐药相关的研究进展

卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是妇科肿瘤中最致命的恶性肿瘤,在进行最大限度的肿瘤细胞减灭术后需结合铂类药物及紫杉醇联合化疗。多数临床化疗结果表明,EOC患者肿瘤复发后常引起化疗药物的耐药,导致预后差、病死率高。锌指E盒结合同源框1(zinc finger E-box-binding homeobox 1,ZEB1)是多种肿瘤发生、发展、迁移、转移和侵袭的重要调控因子。ZEB1可能通过调控上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程、非编码RNA(如miRNA、lncRNA)调控影响卵巢癌耐药;此外,ZEB1还可介导p73和BRCA1相关的表观遗传调控参与卵巢癌的耐药。本文从ZEB1的结构与生理功能、在卵巢癌发生发展和在卵巢癌耐药中的作用及其可能涉及的机制,以及其作为卵巢癌生物标志物的潜力等方面做一综述,为临床治疗EOC寻找新的治疗策略。

miR-192-5p通过靶向ZEB2调控胰腺癌PANC-1细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-192-5p靶向E盒锌指结合同源框2(ZEB2)对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法:利用TCGA数据库数据分析miR-192-5p和ZEB2在胰腺癌组织中的表达及两者的相关性。采用qPCR法和WB法分别检测人正常胰腺上皮细胞HPNE和胰腺癌PANC-1细胞中miR-192-5p和ZEB2的表达水平。利用脂质体转染技术转染PANC-1细胞,实验分为miR-192-5p mimic组、Mimic NC组、miR-192-5p inhibitor组、Inhibitor NC组、Mimic NC+pcDNA3.1组、miR-192-5p mimic+pcDNA3.1组、miR-192-5p mimic+pcDNA3.1-ZEB2组。CCK-8法、克隆形成、划痕愈合、Transwell实验分别检测转染PANC-1细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。qPCR法、WB法、双重免疫荧光实验检测PANC-1细胞中ZEB2、E-cadherin、vimentin的表达水平。通过生物信息学网站预测miR-192-5p的靶基因,并利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-192-5p对靶基因的调控作用。结果:胰腺癌组织中ZEB2的表达显著高于正常胰腺组织(P<0.01),且胰腺癌组织中miR-192-5p和ZEB2表达呈负相关(r=-0.419,P<0.01)。与HPNE细胞比较,PANC-1细胞中miR-192-5p低表达、ZEB2蛋白高表达(均P<0.01)。miR-192-5p过表达后,PANC-1细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力均显著降低,E-cadherin的mRNA和蛋白表达均上调、vimentin和ZEB2 mRNA和蛋白表达均下调;而抑制miR-192-5p后得到了相反的结果(P<0.05或P<0.01)。miR-192-5p靶向调控ZEB2的表达,过表达ZEB2可部分逆转上调miR-192-5p对PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭和EMT进程的抑制作用。结论:miR-192-5p通过靶向ZEB2调控胰腺癌PANC-1细胞的恶性生物学行为。

过表达miR-23b-3p对甲状腺未分化癌FRO细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨miR-23b-3p对甲状腺未分化癌(ATC)FRO细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 qRT-PCR法检测52例ATC癌组织及其癌旁组织中miR-23b-3p和锌指E盒结合同源框1(ZEB1)的表达水平,并分析两者的相关性。培养人ATC细胞株FRO,将miR-23b-3p mimic及其阴性对照转染至FRO细胞中,qRT-PCR检测miR-23b-3p和ZEB1 mRNA表达水平。体外三维培养观察细胞血管生成拟态(VM)形成能力;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;Western blotting检测ZEB1、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达水平,双荧光素酶报告实验验证miR-23b-3p和ZEB1的靶向调控关系。结果 ATC组织中miR-23b-3p表达水平低于癌旁组织,而ZEB1的表达水平高于癌旁组织,且两者在ATC组织中的表达水平呈负相关。过表达miR-23b-3p能显著下调ZEB1表达水平,抑制FRO细胞VM形成以及侵袭和迁移能力,同时抑制细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达。荧光素酶报告实验证实ZEB1是miR-23b-3p的靶基因。结论 过表达miR-23b-3p可能通过靶向下调ZEB1表达抑制FRO细胞的侵袭和迁移能力。

LncRNA AC009686.2促进乳腺癌细胞增殖和侵袭

长非编码RNAs(long non-coding RNAs, LncRNAs)作为一类基因表达的调控因子,在多种肿瘤的发生发展中发挥关键作用,然而LncRNAs在乳腺癌中的作用及相关机制尚未完全阐明。为了寻找在乳腺癌发生发展中起关键作用的LncRNAs,本研究通过分析TCGA数据库发现,LncRNA AC009686.2在乳腺癌组织中表达明显高于正常组织,并且与乳腺癌病人的预后不良正相关。qRT-PCR分析发现LncRNA AC009686.2在乳腺癌细胞中的表达明显上调,其中在乳腺癌细胞MCF7、T47D、ZR7530、BT549、HCC1937、MDA-MB-231和SKBR3的表达量分别是MCF10A细胞的6.58倍、5.66倍、7.29倍、9.06倍、6.89倍、11.17倍和5.38倍。在相对高表达的MDA-MB-231和BT549细胞中干扰LncRNA AC009686.2能明显抑制细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力,并且诱导细胞发生G1 /S期阻滞,其中干扰LncRNA AC009686.2表达的乳腺癌细胞MDA-MB-321和BT549的克隆抑制率分别为对照组的0.496%,0.438%和0.495%,0.353%。同时干扰LncRNA AC009686.2能下调细胞周期蛋白D2(cyclinD2,CCND2)和锌指E盒结合同源框1(zinc finger E-box binding homeobox1,ZEB1)的蛋白质水平。而在乳腺癌细胞中过表达ZEB1能明显逆转干扰LncRNA AC009686.2引起的细胞侵袭能力下降。进一步通过在线软件JASPAR数据库分析发现LncRNA AC009686.2的启动子存在ZEB1结合位点,过表达ZEB1能上调细胞中LncRNA AC009686.2的表达水平。总之,LncRNA AC009686.2在乳腺癌中高表达,通过上调细胞周期蛋白D2和上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关分子ZEB1促进乳腺癌细胞增殖和侵袭,而ZEB1能正向调控LncRNA AC009686.2的表达。本研究将为阐明AC009686.2在乳腺癌中的作用和相关分子机制提供理论依据。

长链非编码RNA SNHG16对人宫颈癌细胞SiHa迁移侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNHG16通过调控微RNA(miR)-216-5p/锌指E盒结合同源框1(ZEB1)轴对人宫颈癌细胞SiHa迁移、侵袭的影响及机制。方法将对数生长期人宫颈癌细胞SiHa随机分为干扰小RNA(siRNA)组、阴性对照组和空白组。siRNA组、阴性对照组SiHa细胞应用脂质体转染法分别进行lncRNA SNHG16-siRNA、阴性对照-siRNA质粒转染,空白组细胞不作处理。转染后48 h,采用倒置荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法测定各组SiHa细胞lncRNA SNHG16 mRNA相对表达量,生物信息学软件靶向预测和双荧光素酶实验验证lncRNA SNHG16与miR-216-5p的靶向关系,划痕实验测定各组细胞迁移能力,Transwell小室实验测定各组细胞侵袭能力,qRT-PCR测定各组细胞miR-216-5p、ZEB1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA相对表达量,Western blot法测定各组细胞ZEB1、E-cadherin相对表达量。结果转染48 h后,各组细胞转染效率均>80%;siRNA组SiHa细胞lncRNA SNHG16 mRNA相对表达量显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组lncRNA SNHG16 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。LncRNA SNHG16与miR-216-5p基因3′UTR存在互补结合位点;siRNA组野生型荧光素酶报告质粒相对活性值显著高于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组野生型荧光素酶报告质粒相对活性值比较差异无统计学意义(P>0.05)。siRNA组SiHa细胞迁移率显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05);siRNA组每个视野平均穿膜细胞数显著少于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组每个视野平均穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。siRNA组SiHa细胞miR-216-5p mRNA相对表达量、E-cadherin mRNA及蛋白相对表达量均高于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组miR-216-5p mRNA相对表达量、E-cadherin mRNA及蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);siRNA组SiHa细胞ZEB1 mRNA及蛋白相对表达量均显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05),空白组与阴性对照组ZEB1 mRNA及蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论沉默lncRNA SNHG16可抑制人宫颈癌细胞SiHa的迁移与侵袭能力,其作用机制可能与调控miR-216-5p/ZEB1轴相关基因和蛋白表达有关。

丝甘蛋白聚糖促进非小细胞肺癌的侵袭与转移

丝甘蛋白聚糖(serglycin,SRGN)在肿瘤细胞的侵袭与转移中具有广泛的研究前景。本研究报道SRGN与肺癌细胞侵袭与转移能力之间的相关性。首先,通过检测SRGN在正常肺上皮细胞株BEAS-2B及不同侵袭与转移能力的肺癌细胞株95C、95D中的表达差异。利用shRNA干扰技术,在侵袭与转移能力强的95D细胞中建立稳定干扰SRGN表达的95D/sh SRGN的细胞株,并通过RT-q PCR、Western印迹、酶联免疫吸附测定验证其敲除效率。结果显示:干扰SRGN可抑制侵袭与转移性强的95D细胞的侵袭与转移能力,减弱细胞迁移与侵袭等生物学特性,导致上皮标志物上皮细胞钙黏连蛋白(E-cadherin)表达上调,间质标志物纤维连接蛋白1(fibronectin1,FN1)及EMT(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关转录因子锌指E盒结合同源框1(zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)表达下调。进一步分析发现,SRGN与上皮细胞钙黏连蛋白表达成负相关(P=-0.25),而与FN1(P=0.12)及ZEB1(P=0.35)表达成正相关,并且SRGN高表达的患者总生存时间明显少于SRGN低表达组(P=0.0077),SRGN与ZEB1同时高表达的患者,总生存时间显著小于SRGN与ZEB1低表达患者(P=0.0005)。研究结果证实,SRGN促进上皮间质转化发生,增强非小细胞肺癌的侵袭与转移能力,为非小细胞肺癌预后提供参考。