低锌对未成熟大鼠视网膜锌离子转运体3(ZnT-3)mRNA表达的影响

目的:通过观察视网膜锌离子转运体3(ZnT-3)mRNA表达对低锌饮食的反应,探索低锌是否会引起ZnT-3转录水平的调节。方法:将36只雄性SD大鼠(4周龄)随机分为三大组分别喂养2周(第1组)、4周(第2组)、6周(第3组),每组大鼠又随机分为两个亚组分别给予正常锌含量饮食和低锌饮食,第3组低锌饮食大鼠从第4周开始恢复正常饮食。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ZnT-3以及碳酸酐酶2(CA2)、碳酸酐酶14(CA14)的mRNA相对表达量。结果:大鼠锌摄入低下2周后,与空白对照组相比视网膜CA2和CA14的mRNA水平有所降低,而ZnT-3 mRNA表达量有所增高;锌摄入低下4周后,视网膜ZnT-3、CA2和CA14mRNA表达量均明显下降;恢复正常锌饮食后2周,实验组视网膜ZnT-3、CA2和CA14的mRNA的表达回升与对照组无差异。结论:饮食锌的变化将导致大鼠视网膜ZnT-3在转录水平上的调节,含锌酶CA2和CA14 mRNA表达也同时发生变化。为保持视网膜组织内锌含量的稳定,ZnT-3 mRNA表达量随饮食含锌量降低的时间和程度而改变。

康柏西普对体外培养的大鼠Müller细胞锌离子转运体8表达的影响

目的探讨康柏西普(conbercept)对氯化钴(CoCl2)作用下体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞系(rMC-1)ZnT8表达的影响。方法 rMC-1随机分为对照组(DMEM培养基培养)、低氧组(DMEM培养基培养+200μM氯化钴)及实验组(DMEM培养基培养+200μM氯化钴+10μg/mL的康柏西普处理)。结果 Müller细胞培养24 h后,谷氨酰胺合成酶(GS)强表达。低氧组ZnT8 mRNA、蛋白水平表达显著性降低(P<0.05),经康柏西普治疗后其表达显著增加。锌离子探针显示低氧组细胞内锌离子浓度增加、细胞凋亡显著增加,实验组都显著降低;同时外源性锌处理也会显著增加细胞凋亡,经康柏西普治疗后凋亡也显著降低。caspase-3蛋白水平呈现与细胞凋亡相同的结果,即低氧组显著增加,实验组显著降低。结论康柏西普可增加体外培养低氧环境下视网膜Müller细胞ZnT8的表达,抑制低氧诱导的细胞凋亡,降低caspase-3蛋白表达水平,促进细胞增殖。

热惊厥幼龄大鼠脑内Fos和热休克蛋白-70及锌离子转运体3mRNA表达的研究

目的探讨热应激（Heatstress，HS）和热惊厥（Febrileconvulsions，FC）对脑内FOS蛋白、热休克蛋白70（Heatstressprotein-70，HSP-70）和锌离子转运体3（Zinctransporter3，ZnT3）表达的影响。方法清洁级21日龄雄性SD大鼠，体重（52—62）g，由浙江大学医学实验动物中心提供。36只大鼠随机分为正常对照组（8只）和热应激组（28只）。28只热应激处理大鼠中15只达到5级（设为热性惊厥组，Febrileconvulsiongroup，FC），10只未出现惊厥（设为单纯热应激组．Heatst艄group，HS），3只达到2级惊厥，弃用。采用热水浴诱导21日龄大鼠FC模型，应用免疫组织化学技术对Hs和FC大鼠Fos、HSP-70免疫反应性在不同脑区的表达进行分析，原位杂交检测ZnT3表达。计量资料以均数±标准差（x^-±s）表示，首先作正态性W检验和方差齐性检验，符合正态性分布和总体方差相等时，采用方差分析。P〈0．05认为差异具有统计学意义。结果FC组大鼠大脑皮层各区和海马各区Fos阳性细胞数明显高于HS组大鼠（P〈0．01）。HS组和对照组未见HSP-70-IR阳性细胞，而FC组则于大脑皮层、海马、杏仁核、丘脑及下丘脑见大量HSP-70-IR阳性细胞，呈弥漫性分布。FC组海马区域可见明显ZnT3mRNA表达，而HS组和对照组无明显表达。结论FC组海马及大脑皮层各区FOS高表达，表明FC组大鼠脑神经元呈过度兴奋状态，为神经元的早期轻微损伤提供了依据。FC组出现HSP-70迅速表达，而HS组表达阴性，提示FC可能导致神经细胞在很早的时间内发生损伤变性。FC组海马ZnT3mRNA明显表达提示FC组海马区域存在异常增高的锌离子转运。

铅暴露对雄性仔鼠海马锌离子转运体3表达的影响

目的探讨铅暴露对雄性仔鼠海马锌离子转运体3(zinc transporter 3,ZNT3)表达的影响。方法将12只健康SPF级雌性SD大鼠随机分为3组,分别为对照(去离子水)组和低(0.5 g/L乙酸铅)、高(2.0 g/L乙酸铅)剂量铅染毒组,每组4只。采取自由饮水方式进行染毒,自妊娠前10 d至仔鼠断乳(出生后21 d)。采用等离子体发射光谱(ICP-AES)法检测雄性仔鼠全血及海马组织中铅、锌的含量;采用RT-PCR法检测其海马组织中ZNT3 m RNA的表达水平;采用Western blot法检测其海马组织中ZNT3蛋白的表达。结果与对照组比较,各剂量铅染毒组雄性仔鼠全血与海马组织中的铅含量均较高,锌含量均较低,差异有统计学意义(P<0.05);且随着铅染毒剂量的升高,雄性仔鼠全血和海马组织中铅的含量呈上升趋势,锌含量呈下降趋势。与对照组比较,各剂量铅染毒组雄性仔鼠海马组织中ZNT3 m RNA及蛋白的表达水平均较高,差异有统计学意义(P<0.05);但高、低剂量铅染毒组雄性仔鼠海马组织中ZNT3 m RNA及蛋白的表达水平间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论铅暴露上调了大鼠海马组织中ZNT3的表达水平,这可能与铅暴露使海马锌含量的降低有关。

外源性锌离子培养/低氧环境下大鼠Müller细胞活力、锌离子浓度变化及促红细胞生成素的调节作用观察

目的观察加入外源性锌离子培养/低氧环境下大鼠Müller细胞系rMC-1细胞活力、锌离子浓度变化及促红细胞生成素(EPO)的调节作用。方法将rMC-1细胞分为ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组,分别加入ZnCl2、ZnCl2+EPO、等量培养基,继续培养24 h后,采用MTT法检测各组细胞光密度值,计算细胞活力,采用TUNEL法检测各组细胞凋亡率。将rMC-1细胞分为CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组,分别加入CoCl2(诱导低氧环境)、CoCl2+EPO、等量培养基,采用锌离子探针FluoZin-3 AM检测各组细胞荧光强度(以荧光强度表示细胞内锌离子浓度),采用qRT-PCR法检测各组rMC-1细胞内ZnT8 mRNA,采用Western blotting法检测各组rMC-1细胞内ZnT8蛋白。结果ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞活力分别为0.252±0.034、0.342±0.031、0.513±0.040,组间相比,P均<0.05;ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞凋亡率分别为60.326%±5.230%、28.268%±3.756%、15.124%±3.521%,组间相比,P均<0.01。CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞内锌离子浓度分别为6.712%±1.251%、4.723%±0.892%、3.428%±0.522%,组间相比,P均<0.05;CoCl2组rMC-1细胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.224±0.038、2.436±0.187,CoCl2+EPO组分别为0.314±0.030、3.082±0.247,正常对照组分别为0.385±0.025、3.583±0.256,组间相比,P均<0.01。结论外源性锌离子可引起rMC-1细胞活力下降、细胞凋亡率增加,EPO可拮抗此作用。低氧状态下rMC-1细胞内锌离子浓度增加,加入EPO后降低,其机制可能与ZnT8表达升高有关。

锌离子抑制动脉粥样硬化进程中的巨噬细胞泡沫化

【目的】探究锌离子在动脉粥样硬化巨噬细胞泡沫化及斑块形成过程中的影响及其机制。【方法】用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激THP-1细胞建立巨噬细胞泡沫化模型,用油红O染色法检测在0、30和60μmol/L锌浓度环境下泡沫化程度,用荧光标记法检测巨噬细胞对脂质的吞噬情况,用免疫印迹法检测相关清道夫蛋白CD36、SR-A蛋白的表达,用实时荧光定量PCR检测锌离子转运体的mRNA相对表达量。用ApoE^(-/-)小鼠随机分4组:正常饲料组(Chow group)、高脂缺锌组(HFD-ZnD)、高脂正常锌组(HFD)、高脂高锌组(HFD-ZnS)。直至第13周检测小鼠血脂、主动脉斑块及主动脉蛋白表达情况。【结果】缺锌组与正常锌组相比,加oxLDL刺激后巨噬细胞油红O密度显著增加(P <0.05);补充锌离子可减缓巨噬细胞对DiI-oxLDL的摄取(P <0.01);泡沫细胞SRA、CD36蛋白表达增加(P <0.05),15μmol/L的Zn2+处理后与oxLDL组相比,细胞SR-A、CD36蛋白的含量减少(P <0.05)。oxLDL处理组与对照组相比,锌调控-铁调控相关蛋白基因(ZIP)中,ZIP10、ZIP12、ZIP14的mRNA表达量升高(P <0.05),ZIP4、ZIP7、ZIP8的mRNA表达量降低(P <0.05);而锌转运蛋白(ZnT)基因中,ZnT4的mRNA表达量上调(P <0.01),ZnT1的mRNA表达量下调至(P <0.05)。与Chow组对比,HFD组和HFD-ZnD组小鼠低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)分别升高(P <0.05);HFD-ZnD组的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著升高。且HFD-ZnS组较HFD-ZnD组小鼠的LDL-C显著降低(P <0.05)。HFD组和HFD-ZnD组较Chow组小鼠主动脉SR-A表达有升高,HFD-ZnS可显著抑制此升高(P <0.05)。HFD-ZnD组与Chow组相比主动脉内壁斑块面积占总动脉管腔面积的比率显著升高(P <0.01),HFD-ZnS可显著抑制此升高(P <0.01)。【结论】缺锌加重了巨噬细胞脂质沉积,其机制可能是通过上调清道夫受体SR-A、CD36进行调控。锌离子转运体参与巨噬细胞泡沫化及动脉斑块的形成,缺锌可以增加LDL-C、促进高脂饮食诱导的动脉斑块的增加。

尖锐湿疣患者组织中P16INK4A、ZnT1的表达及其与HPV感染和预后的关系

目的探讨尖锐湿疣(CA)患者组织中P16INK4A蛋白、锌离子转运体1(ZnT1)mRNA表达水平及其与人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系。方法选取2019年5月至2022年5月在该院就诊的82例CA患者作为CA组,另选取同期在该院进行包皮环切术或外阴整形术的64名皮肤健康者作为对照组。收集CA组疣体组织及对照组的正常包皮或外阴组织,采用聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交技术进行HPV分型检测,比较CA组与对照组,以及不同HPV分型CA患者P16INK4A与ZnT1 mRNA表达水平。所有CA患者均随访治疗8个月,复发的患者纳入复发组,未复发的患者纳入未复发组,比较两组P16INK4A与ZnT1 mRNA表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析P16INK4A、ZnT1单独及2项指标联合检测对CA预后复发的预测价值。结果82例CA患者中,27例为低危型感染(32.93%),25例为高危型感染(30.49%),30例为混合型感染(36.59%),感染HPV亚型包括6、11、16、18、31和51。CA组P16INK4A、ZnT1表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。P16INK4A高表达组45例、低表达组37例;ZnT1高表达组43例、低表达组39例。P16INK4A mRNA低表达组与高表达组年龄、性别、疣体数量、疣体位置比较,差异均无统计学意义(P>0.05),疣体直径、病程、HPV分型比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。ZnT1 mRNA低表达组与高表达组年龄、性别、疣体数量、疣体位置比较,差异均无统计学意义(P>0.05),疣体直径、病程、HPV分型比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。混合型、高危型P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显高于低危型,差异均有统计学意义(P<0.05);高危型P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显高于混合型,差异均有统计学意义(P<0.05)。CA患者随访8个月后,有29例复发(复发组),53例未复发(未复发组)。复发组P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显高于未复发组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,P16INK4A、ZnT1 mRNA单独及2项指标联合检测预测CA预后复发的曲线下面积(AUC)分别为0.840、0.880、0.963,P16INK4A与ZnT1 mRNA联合检测预测CA预后复发的AUC大于2项指标单独检测(Z_(二者联合-P16INK4A)=2.097,P=0.036;Z_(二者联合-ZnT1)=2.074,P=0.038)。结论CA患者疣体组织中P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显升高,其表达水平与HPV感染密切相关。

食管鳞癌组织中LIV-1蛋白的表达及预后分析

目的比较LIV-1蛋白高表达组与低表达组中食管鳞癌患者临床特征及预后。方法收集2012年2月至2016年8月139例(T3N0-3M0)食管鳞癌患者根治术后石蜡组织为研究对象,36例癌旁正常食管上皮组织作为对照,用免疫组织化学方法检测锌离子转运体LIV-1蛋白的表达情况;根据LIV-1蛋白表达水平不同分成高表达组、低表达组,并进行中位随访时间31个月的随访。结果(1)LIV-1蛋白低表达患者66例(47.5%),高表达患者73例(52.5%),两组间年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、淋巴结状态差异无统计学意义(P>0.05);(2)在正常食管上皮组织、食管鳞癌组织中,LIV-1蛋白高表达率分别为11.1%、52.5%;(3)LIV-1蛋白低表达组患者的总生存(OS)与无病生存期(DFS)明显好于高表达组。(4)Cox回归多因素分析提示,LIV-1蛋白高表达组的死亡风险显著高于低表达组。结论LIV-1蛋白高表达是食管鳞癌的独立危险因素。LIV-1蛋白表达水平与食管鳞癌患者分化程度、淋巴结状态无关。

大鼠ZnT1基因siRNA慢病毒载体构建及筛选

目的:构建并筛选针对SD大鼠锌离子转运体1(ZnT1)的siRNA慢病毒载体。并检测其在大鼠神经元中的作用。方法:设计并合成针对ZnT1基因的3条(A,B,C)siRNA序列与1条阴性对照序列,将以上序列退火与pFU-GW-iRNA质粒相连接,通过测序鉴定后,分别与慢病毒包装质粒共感染293T细胞,检测收获病毒滴度后感染体外培养的SD大鼠脑皮层神经细胞,设置感染复数(MOI)分别为1,3,6,8,于转染后72 h计算转染效率。在最佳MOI值下,设置未经病毒感染组(CON组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和慢病毒阳性干扰组(ZnT1-siR-NA-A组,ZnT1-siRNA-B组,ZnT1-siRNA-C组),72 h后利用Western blot技术检测ZnT1的表达情况,确定对ZnT1蛋白的最有效的干扰序列与抑制效率。结果:测序证实目的干扰序列已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒,收获的慢病毒颗粒滴度为8×108TU/ml,其在MOI=6时对神经细胞的转染效率最高(93%),并保持神经细胞良好的生存状态。转染后ZnT1的表达被不同程度的抑制,A,B,C三种干扰序列对ZnT1的抑制率分别为47.74%±1.40%,81.19%±1.36%,94.10%±2.41%。结论:成功构建了ZnT1-siRNA慢病毒载体,其在MOI=6时对神经细胞具有最佳的转染效率,并有效沉默神经细胞中ZnT1蛋白的表达。

Ano5基因敲除小鼠成骨增强机制的初步研究

目的初步探讨导致Ano5基因敲除小鼠(Ano5^(-/-))成骨增强的潜在机制。方法选取出生2~3天小鼠颅骨成骨细胞(mCOB)进行原代培养,CCK-8实验观察细胞增殖能力,荧光探针染色检测胞内Zn^(2+)离子浓度。利用Agilent Mouse lncRNA V3芯片检测12周雄鼠胫骨组织差异表达基因,实时定量PCR(qRT-PCR)检测胫骨组织及m COB成骨分化过程中锌离子转运体和作用相关基因的表达水平。结果Ano5^(-/-)小鼠的mCOB增殖能力明显增强;细胞内Zn^(2+)浓度在成骨分化的第21天升高。锌离子调控基因Pde4d在骨组织和m COB成骨分化晚期的表达均下降,介导Zn^(2+)胞内转运的基因Zip-8、Zip-14表达增强,而介导Zn^(2+)胞外转运的基因Znt-5、Znt-7表达均降低。结论Ano5基因敲除后通过调控Zn^(2+)转运体相关基因表达改变成骨细胞内Zn^(2+)浓度,可能造成Pde4d-cAMP-CREB轴功能障碍,导致Ano5^(-/-)小鼠成骨功能增强。

急性热应激与热惊厥幼龄大鼠海马ZnT3 mRNA表达和代谢变化的^1H-MRS波谱研究

目的探讨氢质子磁共振波谱分析（^1H-MRS）结合神经病理手段对急性热应激（HS）和热惊厥（FC）后脑神经元代谢和损伤的早期检测价值。方法采用热水浴诱导21d龄大鼠FC模型，应用^1H-MRS检测HS和FC后脑内N-乙酰天门冬氨酸（NAA）、复合胆碱（Cho）、肌酸（Cr）和乳酸（Lac）含量的变化，原位杂交检测海马锌离子转运体3（ZnT3）mRNA表达。结果MRS检测结果显示对照组、HS组与FC组NAA／Cr比值分别为1．50±0．42，1．57±0．50和1．61±0．37，Cho／Cr比值分别为0．93±0．27，1．13±0．17和1．28±0．31，各组间差异均无统计学意义（P〉0．05）；Lac／Cr仅见于FC组，为0．64±0．23。FC组海马齿状回检测到ZnT3 mRNA表达。结论Lac波峰是惊厥性神经元损伤的特征性^1H-MRS变化；ZnT3与海马苔藓纤维再生性发芽密切相关；单次短暂的FC发作也能使脑神经元早期发生不同于HS的显著的神经活性物质表达和物质代谢的变化，对脑神经元造成一定的损伤。

热惊厥幼龄大鼠脑内Prolactin蛋白及Zinc transporter 1mRNA表达

目的探讨热应激（Heat stress，HS）和热惊厥（Febrile convulsions，FC）对脑内催乳素蛋白（Prolactin，PRL）和锌离子转运体1（Zinc transporter 1，ZnT1）表达的影响，探讨FC的神经免疫学机制。方法实验在浙江大学附属邵逸夫医院中心实验室进行。采用热水浴诱导FC模型。21d龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组（8只）和热应激组（28只），28只热应激处理大鼠中15只达到5级（设为热性惊厥组，FC），10只未出现惊厥（设为单纯热应激组，HS），3只达到2级惊厥，弃用。应用免疫组织化学技术对HS和FC大鼠PRL免疫反应性在不同脑区的表达进行分析，原位杂交检测ZnT1表达。各组阳性细胞数采用方差分析进行统计。结果①对照组大脑皮层偶见零星表达，着色淡且无定位分布特征。HS组PRL-IR阳性细胞在大脑皮层PIR、Ent和RS区免疫染色较深，PRH、PAR和Fr区染色较浅；另外PRL-IR阳性细胞还分布于丘脑中线一带；而FC组则于大脑皮层、海马、杏仁核、丘脑及下丘脑见大量PRL-IR阳性细胞，呈弥漫性分布，无明显核团分布特征。②HS和FC两组大脑皮层各区PRL-IR阳性细胞数均明显高于对照组（P〈0．01）。FC组大鼠大脑皮层PIR、Ent、RS区PRL-IR阳性细胞数与HS组大鼠差异无统计学意义（F值分别为688．9、744．3、0．56，P〉0．05），PRH和PAR区FC组明显高于HS组（，值分别为2．68、1．48，P〈0．01）。③FC组海马区域可见明显ZnT1 mRNA表达，而HS组和对照组无明显表达。结论①PRL在HS组和FC组大脑皮层各区明显表达，而FC组在海马和杏仁核等前脑结构内亦有明显表达，表明PRL不仅与热应激的中枢调控有关，也参与海马等前脑结构对惊厥活动的中枢调控机制。②FC组海马ZnT1 mRNA明显表达提示FC组海马区域存在异常增高的锌离子转运.