尖锐湿疣患者组织中P16INK4A、ZnT1的表达及其与HPV感染和预后的关系

目的探讨尖锐湿疣(CA)患者组织中P16INK4A蛋白、锌离子转运体1(ZnT1)mRNA表达水平及其与人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系。方法选取2019年5月至2022年5月在该院就诊的82例CA患者作为CA组,另选取同期在该院进行包皮环切术或外阴整形术的64名皮肤健康者作为对照组。收集CA组疣体组织及对照组的正常包皮或外阴组织,采用聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交技术进行HPV分型检测,比较CA组与对照组,以及不同HPV分型CA患者P16INK4A与ZnT1 mRNA表达水平。所有CA患者均随访治疗8个月,复发的患者纳入复发组,未复发的患者纳入未复发组,比较两组P16INK4A与ZnT1 mRNA表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析P16INK4A、ZnT1单独及2项指标联合检测对CA预后复发的预测价值。结果82例CA患者中,27例为低危型感染(32.93%),25例为高危型感染(30.49%),30例为混合型感染(36.59%),感染HPV亚型包括6、11、16、18、31和51。CA组P16INK4A、ZnT1表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。P16INK4A高表达组45例、低表达组37例;ZnT1高表达组43例、低表达组39例。P16INK4A mRNA低表达组与高表达组年龄、性别、疣体数量、疣体位置比较,差异均无统计学意义(P>0.05),疣体直径、病程、HPV分型比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。ZnT1 mRNA低表达组与高表达组年龄、性别、疣体数量、疣体位置比较,差异均无统计学意义(P>0.05),疣体直径、病程、HPV分型比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。混合型、高危型P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显高于低危型,差异均有统计学意义(P<0.05);高危型P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显高于混合型,差异均有统计学意义(P<0.05)。CA患者随访8个月后,有29例复发(复发组),53例未复发(未复发组)。复发组P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显高于未复发组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,P16INK4A、ZnT1 mRNA单独及2项指标联合检测预测CA预后复发的曲线下面积(AUC)分别为0.840、0.880、0.963,P16INK4A与ZnT1 mRNA联合检测预测CA预后复发的AUC大于2项指标单独检测(Z_(二者联合-P16INK4A)=2.097,P=0.036;Z_(二者联合-ZnT1)=2.074,P=0.038)。结论CA患者疣体组织中P16INK4A、ZnT1 mRNA表达水平明显升高,其表达水平与HPV感染密切相关。

大鼠ZnT1基因siRNA慢病毒载体构建及筛选

目的:构建并筛选针对SD大鼠锌离子转运体1(ZnT1)的siRNA慢病毒载体。并检测其在大鼠神经元中的作用。方法:设计并合成针对ZnT1基因的3条(A,B,C)siRNA序列与1条阴性对照序列,将以上序列退火与pFU-GW-iRNA质粒相连接,通过测序鉴定后,分别与慢病毒包装质粒共感染293T细胞,检测收获病毒滴度后感染体外培养的SD大鼠脑皮层神经细胞,设置感染复数(MOI)分别为1,3,6,8,于转染后72 h计算转染效率。在最佳MOI值下,设置未经病毒感染组(CON组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和慢病毒阳性干扰组(ZnT1-siR-NA-A组,ZnT1-siRNA-B组,ZnT1-siRNA-C组),72 h后利用Western blot技术检测ZnT1的表达情况,确定对ZnT1蛋白的最有效的干扰序列与抑制效率。结果:测序证实目的干扰序列已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒,收获的慢病毒颗粒滴度为8×108TU/ml,其在MOI=6时对神经细胞的转染效率最高(93%),并保持神经细胞良好的生存状态。转染后ZnT1的表达被不同程度的抑制,A,B,C三种干扰序列对ZnT1的抑制率分别为47.74%±1.40%,81.19%±1.36%,94.10%±2.41%。结论:成功构建了ZnT1-siRNA慢病毒载体,其在MOI=6时对神经细胞具有最佳的转染效率,并有效沉默神经细胞中ZnT1蛋白的表达。

热惊厥幼龄大鼠脑内Prolactin蛋白及Zinc transporter 1mRNA表达

目的探讨热应激（Heat stress，HS）和热惊厥（Febrile convulsions，FC）对脑内催乳素蛋白（Prolactin，PRL）和锌离子转运体1（Zinc transporter 1，ZnT1）表达的影响，探讨FC的神经免疫学机制。方法实验在浙江大学附属邵逸夫医院中心实验室进行。采用热水浴诱导FC模型。21d龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组（8只）和热应激组（28只），28只热应激处理大鼠中15只达到5级（设为热性惊厥组，FC），10只未出现惊厥（设为单纯热应激组，HS），3只达到2级惊厥，弃用。应用免疫组织化学技术对HS和FC大鼠PRL免疫反应性在不同脑区的表达进行分析，原位杂交检测ZnT1表达。各组阳性细胞数采用方差分析进行统计。结果①对照组大脑皮层偶见零星表达，着色淡且无定位分布特征。HS组PRL-IR阳性细胞在大脑皮层PIR、Ent和RS区免疫染色较深，PRH、PAR和Fr区染色较浅；另外PRL-IR阳性细胞还分布于丘脑中线一带；而FC组则于大脑皮层、海马、杏仁核、丘脑及下丘脑见大量PRL-IR阳性细胞，呈弥漫性分布，无明显核团分布特征。②HS和FC两组大脑皮层各区PRL-IR阳性细胞数均明显高于对照组（P〈0．01）。FC组大鼠大脑皮层PIR、Ent、RS区PRL-IR阳性细胞数与HS组大鼠差异无统计学意义（F值分别为688．9、744．3、0．56，P〉0．05），PRH和PAR区FC组明显高于HS组（，值分别为2．68、1．48，P〈0．01）。③FC组海马区域可见明显ZnT1 mRNA表达，而HS组和对照组无明显表达。结论①PRL在HS组和FC组大脑皮层各区明显表达，而FC组在海马和杏仁核等前脑结构内亦有明显表达，表明PRL不仅与热应激的中枢调控有关，也参与海马等前脑结构对惊厥活动的中枢调控机制。②FC组海马ZnT1 mRNA明显表达提示FC组海马区域存在异常增高的锌离子转运.