中药材分子鉴别新方法:锚定引物扩增多态性DNA的研究

为了寻找稳定性好、可操作性强的分子鉴定新方法,在充分吸取RAPD优势的基础上,对其引物和退火温度进行了改进。本文以人参、西洋参为例进行了方法的探索和各种验证,并推广应用到天花粉以及白芷类药材的鉴别。结果显示引物Pg-q36F得到人参、西洋参及其9种伪品的多态性条带。对于人参、西洋参的鉴别结果与文献鉴别方法结果一致,并且具有更高的稳定性。引物TkS1-64F得到了天花粉及其11种伪品的多态性条带,引物AfS1-100F得到白芷及其3种伪品的多态性条带,均能准确鉴别各种药材。实验结果证明本方法具有简单易行、稳定性和重复性好、提供的信息量大等优点,是一种极具前途的中药材分子鉴定新方法,被命名为锚定引物扩增多态性DNA(anchored primer amplification polymorphism DNA,APAPD)。

锚定引物扩增多态性DNA分子标记鉴别番茄抗根结线虫病品种的研究

以抗病材料Ryau96172I和感病材料Rutagus以及所需鉴定的番茄品种为试验材料,根据Mi-1.2和Mi-1.1设计引物,利用改良SDS法提取番茄基因组DNA,用锚定引物扩增多态性DNA分子标记法标记不同番茄品种。同时利用爪哇根结线虫虫卵以5 000粒/株,接种苗龄为25 d,室内人工接种不同番茄品种。接种结果得到抗病材料2份、中抗材料2份、高感材料5份。本试验对APAPD分子标记反应体系的退火温度进行了优化,适宜退火温度为38℃。应用该体系筛选得到特异性引物1条,命名为SF30,特异片段长度为408 bp。综合以上两者结果表明,APAPD分子标记的结果与接种爪哇根结线虫鉴别番茄品种抗性结果相吻合。

随机引物扩增多态性DNA技术在大肠埃希菌分型中的应用

目的:应用随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术分析大肠埃希菌DNA多态性,并对其进行分型,观察敏感株、耐药株基因型之间的关系。方法:利用蛋白酶K、酚-氯仿抽提DNA模板,应用一对随机引物建立RAPD的检测分析方法,并对12株敏感型、15株耐药型(ESBLs)大肠埃希菌进行基因分析。结果:12株敏感型有8种基因型;15株耐药型中有12种基因型。27株大肠埃希菌在250bp处有共同条带;15株耐药型在1200 bp处有共同条带,而敏感型则没有。结论:大肠埃希菌属间有特异性共同条带;耐药菌株中存在共同的特异性条带,与耐药性有关。因此,大肠埃希菌对β-内酰胺类耐药,可利用RAPD基因分型技术进行鉴定。

红花种质的随机扩增多态性DNA分子鉴定

目的:从分子水平探讨红花(Carthamus tinctorius L.)的种内变异,为红花种质的分子鉴定提供依据。方法:用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术和统计学分析方法,对从我国新疆、甘肃、宁夏、河南、山东、山西、河北、安徽、浙江等9省采集的红花22个品种的遗传多样性进行分析。结果:根据RAPD特征图谱,通过在DNA分子水平上的聚类分析,将红花22个品种分为7个类型。RAPD聚类分析表明了品种间的亲缘关系:北方,特别是新疆地区的品种亲缘关系较近,PCR结果极为相似,而南方品种间遗传差异性较大。结论:红花种内存在一定的遗传变异,本研究结果为红花品种鉴定及亲缘关系的探讨提供一定依据。

俄罗斯“和平”号空间站搭载的番茄随机扩增多态性DNA分析

目的从分子水平证实长时间航天搭载的番茄种子后代的遗传物质发生变异。方法利用俄罗斯“和平”号空间站搭载6年的番茄种子地面种植,进行随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpoly morphicDNA,RAPD)检测。结果空间搭载的番茄和地面对照经RAPD分析,40个随机引物中,31个引物扩增的DNA带型一致,9个引物扩增的DNA带型表现多态性。共扩增出269条带,多态性带29条,多态性百分率为10.8%。空间搭载的番茄和对照相比扩增带型均出现差异,且空间搭载的番茄之 间的带型也不同。和地面对照相比,空间搭载的番茄中5号植株的DNA变异程度最大,3号植株变异程度最小。结论长时间航天飞行可引起番茄遗传物质DNA水平上的变异。

长江鲢遗传多样性的随机扩增多态DNA分析

运用４０个１０碱基随机引物对长江中游鲢的遗传多样性进行了随机扩增多态ＤＮＡ （ＲＡＰＤ）分析。所用引物中，能在鲢不同个体基因组中扩增出多态ＤＮＡ带的有１０个，占总引物数 的 ２５％．据ＲＡＰＤ带型分析，所取长江鲢自然群体的 １８条样品中，每两个体相比较的遗 传相似度在０．９２８５至０．９７８８之间，平均值为０．９５４３；遗传变异度则在０．０２１２至０．０７１５之 间，平均值为０．０４７２５；群体Ｓｈａｎｎｏｎ表型多样性指数（Ｈｏ）为８．８６１５，Ｓｈａｎｎｏｎ多样性值（Ｈ）为０．０６２４。 讨论了这些数据所反映的长江鲢遗传多样性和鱼类种质资源评价问题。

镉胁迫下萝卜基因组DNA甲基化敏感扩增多态性分析

应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析了重金属镉(cd)胁迫处理后萝卜基因组DNA甲基化程度的变化。结果表明,经50、250和500mg/L CdCl_2处理后,MSAP比率分别为37%、43%和51%,均高于对照(34%);全甲基化率(双链C^mCGG)分别为23%、25%和27%,而其对照为22%,表明重金属CdCl_2胁迫后,某些位点发生了重新甲基化。萝卜叶片DNA中总甲基化水平的增加与CdCl_2处理浓度呈显著正相关。甲基化变异可分为重新甲基化、去甲基化、不定类型以及与对照相同的甲基化模式等类型,Cd胁迫处理引起的植株基因组DNA甲基化程度的提高主要是重新甲基化。

小菜蛾对杀虫双和杀螟丹抗药性遗传的DNA随机扩增多态性研究

利用室内选育 119代的抗杀虫双和抗杀螟丹小菜蛾Plutellaxylostella品系和敏感品系 ,通过反复回交建立近等基因系。用Operon公司合成的 80个引物对抗杀虫双近等基因系和抗杀螟丹近等基因系小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增 ;在抗杀虫双近等基因系中有 3个引物分别产生了 1条特异扩增带 ,2个引物分别产生了 2条特异扩增带 ,1个引物产生 3条特异扩增带 ;在抗杀螟丹近等基因系中 ,有 4个引物分别产生了 1条特异扩增带 ,1个引物产生了 2条特异扩增带。在培育近等基因系的多次回交过程中 ,与抗性有关的遗传因子被逐步置换到敏感品系的基因组中 ,因此可以认为这些特异带与小菜蛾对杀虫双和杀螟丹的敏感性有关。

向日葵种质资源的随机扩增多态性DNA(RAPD)研究

采用RAPD方法对我国 2 1个向日葵 (HelianthusannuusL .)基因型和 11个国外引进向日葵基因型进行分析 ,构建了它们的指纹图谱。从 80个随机引物中筛选出的 2 5个有效引物共产生 188条DNA片段 ,大小分布在 0 .2 6～1.98kb之间 ,其中 16 4条带具有遗传多态性 ,约占总数的 87.2 % ,平均每个引物扩增的DNA带数为 7.5 2条。 32个向日葵的遗传相似性分析表明 ,各基因型间的Nei氏相似性系数分布在 0 .3987～ 0 .85 3 1之间 ,平均相似性系数为0 .6 2 81。 11个国外向日葵基因型的Nei氏相似性系数分布在 0 .713 4～ 0 .85 3 1之间 ,平均相似性系数为 0 .782 8,说明国外基因型之间的遗传基础比较狭窄。 2 1个国内向日葵基因型的Nei氏相似性系数分布在 0 .475 0～ 0 .82 0 6 ,平均相似性系数为 0 .6 478,说明国内向日葵基因型之间的遗传多态性较为丰富。通过非加权算术平均数聚类(UPGMA)的方法 ,绘制出了 32个向日葵基因型之间的遗传关系树图。 32个向日葵基因型明显地聚成A、B两大类群。 2 1个国内向日葵基因型聚成了A1、A2两个亚类 ,A1组包括 :X10、陕西向日葵、D_S12 、长岭向日葵 6、黑 2_S2_2 、T_C0 8、长岭葵花 4、白葵 3号、BH_10、J_S_B1、张掖白子葵、C10 1_S4 3S4 等 12个基因型 ;A2组包括 :LK30 5_S8?

马尾松随机扩增多态性DNA标记的分离研究

马尾松随机扩增多态性ＤＮＡ标记的分离研究魏令波，唐谦，郑先武，顾万春（中国林业科学研究院林业研究所北京１０００９１）李小兵（中国科学院遗传研究所植物生物技术开放实验室北京１０００１２）关键词马尾松，ＲＡＰＤ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ分离随机扩增多态性ＤＮＡ...

用随机扩增多态性DNA技术对重离子辐照大丽花花色突变体的初步研究

品系为“大雪青”的大丽花幼枝,经兰州重离子加速器提供的80MeV/u12C6+束辐照后,种植在甘肃省定西市临洮新兴花卉公司基地。辐照8Gy的幼枝有一株花色突变体,用随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术对突变体和野生型进行检测分析。琼脂糖凝胶电泳结果表明,所用的10条引物中,有7条引物共扩增出78条带,其中5条引物扩增出了11条多态性片段,从而在DNA水平上证实了两者之间存在着差异,为进一步探讨重离子诱变机理打下基础。

随机扩增多态性DNA技术在中药红曲基原菌系统分类中的应用

目的 :建立中药红曲基原菌的随机扩增多态性 DNA( RAPD)分析方法。 方法 :以 CTAB法提取紫色红曲霉等 7种红曲霉和 1株土曲霉的基因组 DNA;溴化乙啶荧光强度和分光光度双重测定法确定 DNA浓度 ;琼脂糖凝胶电泳法检测 PCR扩增产物 ,PHYL IP 3.5 c进行聚类分析。 结果 :从 6 0个随机引物中筛选出 S2 82 等 10个引物的扩增产物谱带多 ,特征好 ;红曲霉属种间指纹图谱差异较大 ,呈现出明显的 DNA扩增产物多态性。 结论 :RAPD分析技术可作为真菌系统分类的客观而有效的手段之一。

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的随机扩增多态性DNA分型研究

目的 对产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌的耐药现状进行分析研究,对耐药株进行基因分型流行病学研究。方法 对临床分离的195株肺炎克雷伯菌进行ESBLs检测并采用微量稀释法测定MIC值,判断细菌的耐药性;对产ESBLs菌株以随机扩增多态性DNA分型法（RAPD）进行基因分型。结果 产ESBLs肺炎克雷伯菌占23％,其中51％来源于重症监护病房（ICU）;ESBLs阳性细菌对12种抗生素的耐药性远远高于ESBLs阴性菌;20株产ESBLs肺炎克雷伯菌分为11型。结论 本院神经外科SICU、呼吸科RICU存在产ESBLs肺炎克雷伯菌的流行;合理使用抗生素,加强重点病区的消毒隔离措施,是控制医院感染流行的重要措施;RAPD是从分子水平对耐药细菌进行流行病学研究的一种经济、快速、可靠的基因分型方法。

中国鼠疫菌随机引物扩增多态性指纹图谱

目的 对中国不同鼠疫自然疫源地鼠疫菌染色体的分析和比较发现其近缘关系进而从分子水平进行分型。方法 用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术。结果 第 1条引物将中国的鼠疫菌分为 11个类型 ,每个类型都有一定的条带规律和地理分布范围。第 2条引物将我国的鼠疫菌分为 5个类型。结论 随机扩增多态性DNA(RAPD)

5种白蚁基因组DNA随机扩增多态性研究

采用 RAPD(Random amplified polymorphic DNA)技术对尖唇异白蚁 (H eterotermesaculabialis)、黄肢散白蚁 (Reticulitermes flaviceps)、扩头散白蚁 (R.ampliceps)、细颚木鼻白蚁(Stylotermes angustignathus)和陇南树白蚁 (Glyptotermes longnanensis)等 5种白蚁的基因组DNA多态性进行了初步分析。在所用的 2 0个随机引物中有 4个引物能扩增出稳定的带型 ,5种白蚁 6个群体共扩增出 43条带 ,均为多态性片段 ;同一种类不同群体和同一群体不同品级间存在一定程度的多态性 ,但种间扩增片段差异显著大于种内差异。以 UPGMA方法将扩增片段分布和共享度数据矩阵进行聚类分析 。

半夏种质资源的随机扩增多态性DNA技术分析

目的分析半夏种质资源在分子水平上的遗传多样性。方法应用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对21份半夏种质资源进行检测。结果29个引物共得到162条扩增DNA片段,其中123条(75.9%)的片段具多态性,揭示了半夏居群间较丰富的遗传多样性。利用UPGMA法进行聚类分析表明,所有材料可划分为3类,根据RAPD遗传相似系数划分的类群同地理分布有一定关系。结论半夏种质资源在分子水平上确实存在较大遗传差异。RAPD标记可作为构建半夏DNA指纹图谱的有效工具。

七种媒介硬蜱基因组随机扩增多态性DNA分析

目的 研究 7种硬蜱的基因组随机扩增多态性DNA (RAPD)以及种间的遗传距离。 方法 用 5条不同的多聚核苷酸单链引物对草原革蜱、森林革蜱、青海血蜱、台湾血蜱、刻点血蜱、龟形花蜱、卵形硬蜱 7种硬蜱基因组DNA进行随机扩增 ,分析DNA图谱并计算 7种硬蜱间的遗传距离。 结果 7种硬蜱基因组随机扩增产物均有各自独特的DNA条带 ,种间的平均遗传距离为 0 71。 结论 RAPD技术可以区分这 7种硬蜱。

一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性(RSAP)的建立与优化

了避开基于限制性酶切位点分子标记技术的DNA酶切环节，简化其复杂的程序，试验以辣椒为材料，建立了一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性（RSAP），并对其反应体系进行了优化，对RSAP适用性、重复性进行了检验。结果显示，RSAP技术的引物为2条长度均为18bp的引物，引物的3’端为4～6个碱基的限制性酶切位点序列，接着是12～14个碱基的随机序列，2条引物的限制性位点和随机序列不同；PCR扩增的前5个循环采用35C的退火温度，随后的35个循环采用48℃的退火温度；在25μL反应体系中，模板DNA用量为20ng，Mg^2＋浓度为2．5mmol／L，dNTPs浓度为0．2mmol／L，TaqDNA聚合酶用量为1．5U，2条引物浓度均为600nmol／L;RSAP技术重复性好，适用性广泛，是一种操作简便、产率中等、稳定可靠的DNA标记技术。

检测植物DNA扩增多态性方法的比较和改进

以辽东栎(Quercus liaotungensis Koidz.)、锦鸡儿(Cargagana ssp.)和野大豆(Glycine soja(L.)Sieb.etZucc.)为材料,比较了随机扩增多态DNA(RAPD)和DNA扩增指纹(DAF)方法。用RAPD的琼脂糖胶电泳和溴乙锭染色,RAPD和DAF谱一般不足10条带。用DAF的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染,极大地提高了RAPD的灵敏度和分辨率,多达20～40个产物。用3＇末端完全相同的引物,RAPD和DAF有同样的扩增谱,说明两种方法有相似的机理。降低胶的浓度可提高RAPD和DAF的分辨率,达40～80条带。琼脂糖电泳分离的溴乙锭显示的单荧光带,用PAGE和银染可分辨出多个片段。分子克隆证实单荧光带的分子量异质性。在用Taq DNA多聚酶的条件下,RAPD和DAF的再现性均良好。