猫锡兰钩虫rDNA ITS1的扩增及分子鉴定

为了对从猫粪便样品中分离的钩虫虫卵进行种类鉴定,本研究提取该虫卵基因组DNA,根据核糖体内转录间区1(ITS1)的保守序列设计钩虫属引物,通过PCR扩增、克隆、测序、相关软件分析,建立系统进化树,从分子水平对其进行种类鉴定。结果表明扩增出404 bp DNA片段,测序结果显示该片段包括309 bp ITS1和95 bp的5.8S rDNA,与NCBI中登录的序列进行比对以及采用Clustal X和MEGA5.1软件分析确定该钩虫为锡兰钩虫。这是我国首次建立钩虫的分子鉴定方法,也是40年来再次发现猫源锡兰钩虫,为锡兰钩虫分子生物学和分子流行病学研究奠定了基础。

锡兰钩虫TIMP基因的序列分析与原核表达

为表达锡兰钩虫金属蛋白酶组织抑制剂(Ace-TIMP)重组蛋白,本实验根据GenBank中锡兰钩虫TIMP (ANCCEY-04405)基因序列设计引物扩增犬源锡兰钩虫Ace-TIMP基因,利用生物信息学软件对其序列鉴定;根据编码的氨基酸序列进行遗传进化关系分析;构建其重组表达质粒p ET-32a-Ace-TIMP-MP,转化大肠杆菌,并经诱导表达。结果显示,Ace-TIMP基因ORF为648 bp,编码215个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽,具有TIMP家族Cys-X-Cys特征性序列。进化树分析显示Ace-TIMP与犬钩虫TMP-2位于同一分支。经诱导表达与纯化,获得了分子质量约为42 ku的可溶性融合蛋白。本实验克隆了Ace-TIMP基因并利用原核表达系统表达了可溶性的重组蛋白,为Ace-TIMP生物学活性的研究和免疫潜能的评价奠定了基础。

锡兰钩虫HPI基因的原核表达与生物信息学分析

目的克隆表达锡兰钩虫血小板抑制剂(hookworm platelet inhibitor, HPI)基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法 以锡兰钩虫cDNA 为模板,参考已公布的犬钩虫血小板抑制剂(AcaHPI)基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR 扩增其AceHPI基因序列,并将其连接至pET-28a表达载体,诱导其表达并纯化。利用在线软件对其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比对和生物信息学分析。结果 锡兰钩虫AceHPI基因的ORF序列全长603 bp,编码200个氨基酸,与犬钩虫AcaHPI氨基酸序列同源性为91%。构建的重组表达质粒pET28a-AceHPI经诱导表达与纯化,获得了分子质量约为26 kDa的可溶性融合蛋白。预测分析表明该蛋白为疏水蛋白,前17个氨基酸为信号肽序列且无跨膜结构域。结论 成功克隆表达了AceHPI基因并对其编码氨基酸进行了生物信息学分析,为进一步研究AceHPI在感染宿主体内的作用机制奠定了基础。

锡兰钩虫SLP-1基因的克隆表达与免疫学特性分析

为了研究锡兰钩虫鞘脂激活蛋白样蛋白(Ace-SLP-1)的免疫学特性,本研究以锡兰钩虫成虫cDNA为模板,根据GenBank中Ace-SLP-1基因序列(DQ855414.1)设计特异性引物,采用RT-PCR扩增Ace-SLP-1基因,结果显示,PCR扩增了Ace-SLP-1基因,其ORF全长315 bp,编码104个氨基酸;利用在线软件对其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示该蛋白为疏水蛋白,前17个氨基酸为信号肽序列且有跨膜结构域等;根据AceSLP-1基因编码氨基酸序列信息将其成熟肽编码基因序列(Ace-XL-SLP-1)克隆至原核表达载体pET-28a中,构建的重组质粒鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示重组Ace-XL-SLP-1蛋白(r Ace-XL-SLP-1)以包涵体形式表达,分子质量为14.4 ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可以分别被鼠His标签MAb及锡兰钩虫感染犬的阳性血清所识别,具有较好的反应原性。将r Ace-XL-SLP-1分别以0~40μg/mL体外刺激健康犬的外周血淋巴细胞(PBMC),采用CCK-8试剂盒检测其对PBMC增殖的影响,结果显示,与对照组相比,20μg/mL与40μg/mL的r Ace-XL-SLP-1均可显著刺激犬PBMC的增殖(P<0.05),表明该重组蛋白能够诱导宿主细胞产生免疫应答反应,免疫原性较好。本研究首次克隆表达了锡兰钩虫成虫Ace-XL-SLP-1基因,并对其免疫学特性做了初步研究,为锡兰钩虫血清学诊断方法的建立和疫苗的研制提供参考数据。

基于cox1基因的棕熊锡兰钩虫分子鉴定与种系发育分析

本次研究旨在利用线粒体细胞色素I(cox1)部分基因(pcox1)对长沙市动物园棕熊粪便分离的钩虫进行种类鉴定,并分析其基因多态性。用PCR技术扩增从棕熊粪便分离的钩虫长沙分离株的pcox1基因,并对其基因序列进行分析。结果显示7条钩虫分离株的pcox1序列片段大小均为423 bp,种内遗传差异为0.0%~0.5%,与GenBank中收录的锡兰钩虫(Ancylostoma ceylanicum)分离株同源性为93.8%~94.8%,与其他钩虫(犬钩虫、巴西钩虫、十二指肠钩虫、猫钩虫和美洲钩虫等)序列相似性低于88.7%;系统发育分析显示,本次研究获得的棕熊钩虫分离株与已知锡兰钩虫聚为一支,与其他钩虫相隔较远。结果表明,长沙市动物园棕熊粪便分离的钩虫为锡兰钩虫,线粒体pcox1基因在锡兰钩虫种内相对保守,与其他钩虫种类序列差异较大,可以作为熊锡兰钩虫分子鉴定及遗传变异研究。

人兽共患锡兰钩虫的研究进展

锡兰钩虫是线形动物门、尾感器纲、圆线目、钩口科、钩口属的一种寄生虫,在亚洲地区广泛流行,可感染犬、猫等多种哺乳动物和人.该虫曾被认为是可忽略的寄生虫;后来的研究表明,锡兰钩虫可引起人体严重的症状,包括“钩虫痒”、腹部不适和贫血等.近年来亚洲地区的分子流行病学调查表明,人体的锡兰钩虫感染与犬、猫的锡兰钩虫感染呈正相关.犬、猫作为锡兰钩虫的自然宿主,可以对人类生活环境造成污染,因此在该病的防控措施中需要对接触犬、猫的人群进行重点保护.

锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆表达与免疫原性分析

为了克隆表达锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶(Ace-GST)基因,制备多克隆抗体并分析其免疫原性,为疫苗候选分子的筛选奠定基础。根据GenBank上锡兰钩虫GST基因序列设计引物,利用RT-PCR法扩增Ace-GST基因,将扩增产物克隆至pET-32a载体并转入E.coli BL21(DE3)宿主菌表达,重组蛋白纯化后免疫昆明小鼠,分别用间接ELISA法和MTT法检测免疫鼠血清IgG抗体水平与脾淋巴细胞增殖情况。结果显示Ace-GST基因ORF全长468 bp,编码155个氨基酸,与ν类GSTs聚为同一分支;重组Ace-GST相对分子质量为36000,可诱导产生特异性IgG抗体,并能显著刺激免疫小鼠脾淋巴细胞增殖。结果表明重组Ace-GST蛋白能诱导昆明小鼠产生特异性免疫应答,具有良好的免疫原性。