锤头型核酶作用机理的研究进展

概述了锤头型核酶的二级结构特征， 动力学反应的特点以及核酶切割反应的催化机制，

蜜瓜ACC氧化酶mRNA的成串锤头型核酶和反义RNA基因的合成和克隆

我们设计和合成了切割蜜瓜成熟果实 ACC氧化酶 m RNA的 GUC86、GU C388、GUC534 的三重锤头型核酶 ( Hh Rz)和阻断转录的反义 RNA( AR)基因 ,并构建了二、四、八联体 Hh Rz和AR基因 .为了在体外和体内检测 Hh Rz是否切割 ACC氧化酶 m RNA,在 E.coli DE3rna-菌株中克隆了同域和跨域作用的 ( Hh Rz) n-AR和靶子 ACC氧化酶 m RNA表达系统 .又构建了植物体组成型和诱导型 ( Hh Rz)

一个双价锤头型核酶在体外对两种不同植物病毒RNA的专一切割作用

根据锤头核酶模型，设计合成了一个以黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ） 外壳蛋白（ＣＰ） 亚基因组ＲＮＡ 为底物的锤头型核酶（ＲＺＣ） 。在证明它能有效切割该底物后，再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒（ＴＭＶ） 移动蛋白（ ＭＰ） 亚基因组ＲＮＡ 的锤头型核酶（ＲＺ１） 相互串联构成了一个双价核酶（ＲＺ１Ｃ） 。体外结果表明，这个双价核酶能与相应的单价核酶ＲＺ１ 和ＲＺＣ 一样专一而有效地切割ＣＭＶＣＰ和ＴＭＶ ＭＰＲＮＡ。

锤头型核酶特异性阻断雄激素受体表达对前列腺癌细胞生长的影响

目的 探讨核酶阻断雄激素受体 (AR )基因表达治疗前列腺癌的可能性。方法 在脂质体介导下 ,锤头型抗雄激素受体核酶表达载体转染前列腺癌细胞 ,采用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测ARmRNA ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测细胞增殖活性 ,流式细胞仪 (FCM )检测细胞周期时相 ,原位末端转移酶标记法检测细胞凋亡。结果 核酶表达载体转染 1～ 5d后 ,前列腺癌细胞ARmRNA水平降低 32 .6 %～ 40 .7% (P <0 .0 5 ) ,细胞生长抑制率 18.2 8%～ 35 .34%(P <0 .0 5 ) ,细胞周期阻滞于G2 M期 ,诱导细胞凋亡 ,细胞凋亡比率增加 2 0 .70 % (P <0 .0 1)。结论 应用核酶特异性切割ARmRNA ,能有效阻断AR基因的表达 ,诱导前列腺癌细胞凋亡 ,有可能成为前列腺癌基因治疗的有效方法之一。

丙型肝炎病毒特异性核酶对HepG2.9706细胞HCV5′NCR基因表达的抑制作用

为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用 ,根据HCV 5′NCR及翻译起始区的二级结构 ,设计及合成了 1个锤头型核酶RzA .将其插入pCI neo表达载体的多克隆位点 ,构建了表达RzA的质粒pHCV RzA .采用转基因细胞模型HepG2 970 6细胞 ,评价了pHCV RzA质粒对HCV 5′NCR调控荧光素酶表达的抑制活性 .结果表明 ,在HepG2 970 6细胞中 ,pHCV RzA以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基因的表达 ,抑制率达 80 % ,提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途径 .

丙型肝炎病毒RNA特异性核酶的切割活性研究

针对丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）的５′非编码区和部分Ｃ区的二级结构，设计并合成了四个不同的锤头型核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅＡ，ｒｉｂｏｚｙｍｅＢ，ｒｉｂｏｚｙｍｅＣ１，ｒｉｂｏｚｙｍｅＣ２）．首先应用体外切割实验筛选出作用于ＨＣＶＲＮＡ起始密码子上游ＧＴＡ↓位点的核酶ＲｚＡ有较好的活性．为初步验证核酶ＲｚＡ在细胞内的切割活性，经脂质体介导，将ＲｚＡＲＮＡ与另一携带该核酶靶基因的质粒表达载体ｐＣｌｎｅｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（载体中荧光素酶基因受核酶靶基因的调控）共转染ＨｅｐＧ２细胞．通过测定荧光素酶基因的表达证实了核酶在细胞内有较好的切割活性．在此实验基础上，把ＲｚＡ基因克隆至ｐＣｌｎｅｏ质粒表达载体中，再次经脂质体介导，将重组的表达载体ｐＣｌｎｅｏＲｚＡ与携带该核酶靶基因的质粒表达载体ｐＣｌｎｅｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ共转染ＨｅｐＧ２细胞，获得了更好的切割效果．

特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。

核酶在我国植物抗病毒领域的研究和应用现状

简要介绍了锤头型和发夹型核酶的结构、功能及催化机制,并对我国利用核酶抗植物病毒病害方面的研究和应用现状作一概述。

专一切割猴免疫缺陷病毒3′端LTR 10拷贝自切割核酶的制备及体外催化活性动力学分析

将锤头型核酶切割的一段靶序列连接在核酶下游构成自切割核酶 .人工合成的自切割核酶基因扩增并克隆在 p Bluescript SK的 Xho - Sal 位点 .通过连续 4次克隆获得 1 0拷贝核酶基因的载体 .体外转录单体核酶和 1 0体核酶后 ,37℃温育 1 5min,至少 85%的 1 0体核酶发生自切割 ,并释放出单体核酶 .反式切割研究表明 ,1 0体核酶表现出极高的催化活性 .尽管 1 0体核酶的浓度不到单体核酶的十分之一 ,在反应初始 2 5min内 ,1 0体核酶的催化产物平均超过单体核酶1 3.31 % .1 0体核酶一级反应速度常数是单体核酶的 1 .86倍 .从这些数据可以推断 ,1

特异切割苹果锈果类病毒的核酶基因的克隆和转录物的体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成和克隆了特异切割苹果锈果类病毒ASSVd正链 (194- 196位点 )或负链 (89- 91位点 )RNA的 2个短臂锤头型核酶基因 :42nt的RzASSVd(+)和 40nt的RzASSVd(- )。经转录获得核酶转录物和3 2 P标记的ASSVd正、负链转录物。将核酶与ASSVd混合 ,5 0℃或 37℃保温 3～ 4h ,进行 8%PAGE(含8mol L尿素 )和放射自显影分析。体外切割检测表明 :2个核酶均具有特异切割活性 ,其中RzASSVd(- )对ASSVd负链的切割活性较高 ,对ASSVd正链不起作用。RzASSVd(+)对ASSVd正链的切割活性较弱 ,对ASSVd负链亦不起作用。在此基础上 ,构建得到双价核酶基因pGEMRzASSVd(± )。

快速制备RNA小分子质量标记的新方法

在锤头型核酶下游增加一段核酶作用的靶序列 ,使之成为自切割的核酶 .将自切割核酶基因合成 ,扩增并克隆在质粒pBluescriptSK上 ,经连续 4次克隆获得含 10个拷贝的自切割核酶基因的载体 .5%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳结果显示 :体外转录过程中多体酶发生了自切割 ,核酶转录物切割成从 70nt到 70 6nt的RNA等梯度带 ,因此 。

通过理性设计在体内获得具有分子间剪切潜力的锤头型适体酶

锤头型适体酶目前已广泛用于基因表达调控,为了维持锤头型核酶高效自剪切的LoopⅠ和LoopⅡ之间的三级结构互作,现有的锤头型适体酶都是基于其stemⅢ或stemⅠ发展而来.为增加锤头型适体酶的多样性和通用性,探索基于stemⅡ的锤头型适体酶,通过理性设计基于stemⅡ的锤头型适体酶的链接体,基于毒蛋白基因ibsC报告体系,结合宿主的生长推测锤头型适体酶响应小分子调控的情况.设计了10种不同长度、不同碱基互补配对程度的链接体.其中7种链接体对应的锤头型适体酶无法发生自剪切;2种可以发生自剪切,但是不受茶碱调控;最终获得一个基于stemⅡ的锤头型适体酶T4,其链接体由4对完全互补配对碱基对组成,这表明由4对完全互补配对碱基对组成的链接体可能更容易获得小分子依赖的锤头型适体酶.在茶碱存在时,含有T4的宿主生长,而茶碱不存在时,其宿主不能生长,这表明锤头型适体酶T4的自剪切活性是受茶碱调控的,成功实现了利用小分子控制大肠杆菌中毒蛋白基因的表达.本研究表明T4是基于stemⅡ的依赖茶碱的锤头型适体酶,表明以锤头型核酶的stemⅡ也可以发展锤头型适体酶;此外,T4具有分子间剪切潜力,有望发展成为利用小分子调控内源性基因表达的工具.

桑花叶萎缩类病毒基因组结构特征及聚类分析

桑花叶萎缩类病毒（Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd）是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。

过量表达马铃薯ataxin-3可增加泛素积累并反向调控本氏烟生长

动物细胞中ataxin-3与泛素特异结合,通过去泛素化阻止蛋白质水解;基因组注释预测ataxin-3同源物存在于植物中,但到目前为止尚未见植物ataxin-3基因功能的研究报道;本研究克隆了马铃薯（Solanum tuberosum） ataxin-3编码基因StAX c DNA,转化StAX于本氏烟（Nicotiana benthamiana）基因组,筛选获得StAX过量表达株系stax-9;测定结果显示,stax-9叶片ataxin-3、UBI 3和CDC48 mRNA积累显著增加,stax-9叶片ataxin-3、寡聚泛素和总蛋白积累分别比WT株系增加了138%、81%和38%,而赤霉素含量仅是WT的1/6;研究结果表明,ataxin-3本氏烟体内过量表达,显著增强了泛素转录和翻译,增加了总蛋白积累,减少了赤霉素积累,导致半矮化表型;结论认为植物ataxin-3通过正向调控泛素和蛋白积累,反向调控生长;本研究为植物ataxin-3功能的进一步理解提供依据。