固定化锤头状ribozyme的初步研究

用共价连接方式将专一切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白ｍＲＮＡ片段的锤头状ｒｉｂｏｚｙｍｅ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ）固定在ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ上，ｒｉｂｏｚｙｍｅ与载体之间有１９个原子的距离，研究并比较了该固定化ｒｉｂｏｚｙｍｅ与游离（非固定化）ｒｉｂｏｚｙｍｅ的底物专一性、催化活性、最适反应温度以及热和保存稳定性。讨论了固定化ｒｉｂｏｚｙｍｅ与固定化酶在性质上的相似性以及固定化ｒｉｂｏｚｙｍｅ研究在理论和应用上的可能意义。

锤头状Ribozyme在修饰核苷酸ψ3′侧的定点剪切

现有知识所知道的锤头状Ribozyme结构中,剪切是在特殊位点的3′侧发生,我们将含GTΨ的酵母丙氨酸tRNA 3′半分子(40聚)作为底物,按Haseloff-Gerlach锤头结构模型设计了一个38聚的Ribozyme分子。在镁离子存在的条件下,GTΨ的3′侧发生预期的体外剪切反应。反应的米氏动力学参数为:K_m:6.7μmol/L,k_(cat):3.4×10^(-3)/min。与此同时,合成了一个17聚的底物类似物,仅以GUU代替上述的GTΨ序列。恒态动力学分析表明,两底物的K_m值大致相同,但k_(cat)值相差达294倍。实验表明,修饰核苷酸Ψ可以是Ribozyme锤头结构中的剪切位点,但具有很低的k_(cat)。

碱基切除修复基因HOGG1特异性锤头状核酶表达载体的构建及其功能的初步研究(英文)

目的阿霉素是一种临床上广泛使用的抗肿瘤药物,但其治疗作用的发挥受到耐药性的限制。目前研究显示阿霉素主要通过诱导活性氧自由基的产生而杀死肿瘤细胞。人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(HOGG1)是一种DNA氧化损伤的修复酶,可特异性的切除由活性氧产生的8-羟基鸟嘌呤。针对这一机制,设计并合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因,构建其真核表达载体并初步探讨在该基因作用下,人肺腺癌A549细胞株对阿霉素的药物敏感性的影响。方法人工设计并合成核酶基因(RZ),将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,阳性重组子由BamH和EcoR酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。大量抽提阳性重组子并在非脂质体转染试剂FuGENE6的介导下引入A549细胞株,RT-PCR(逆转录多聚酶链反应)法鉴定转染,并半定量检测转染细胞中HOGG1mRNA表达的改变。MTT法检测细胞转染前后对阿霉素敏感性的变化;彗星试验检测细胞转染前后DNA氧化损伤修复能力的改变。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列成功克隆入pcDNA3.1(+)中,命名为pcDNA3.1(+)-RZ。经RT-PCR法鉴定质粒成功导入靶细胞中,并检测到转染核酶的靶细胞中HOGG1mRNA表达下降36%,与空白细胞组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测显示转染细胞组对阿霉素的药物敏感性增加,与未转染细胞组之间差异具有统计学意义(P<0.05);彗星试验表明在1.0μg/mL阿霉素作用下,转染细胞组较未转染细胞组DNA损伤程度增加(P<0.05),但无时效关系。结论成功构建HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体。核酶在A549细胞内有效抑制靶基因HOGG1的表达,增加了该细胞对抗肿瘤药物阿霉素的敏感性。为进一步研究HOGG1基因的功能奠定了基础。

蓝氏贾第鞭毛虫PPDK特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建及鉴定

丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvatephos phate dikinase,PPDK)可能是蓝氏贾第鞭毛虫能量代谢中具有催化作用的关键酶桩一。为了进一步探讨该酶在贾第虫能量代谢中的作用,本文采用RNA draw软件分析贾第虫编码PPDK的基因序列并设计特异性反义锤头状核酶(Hammerheade ribozyme),克隆该核酶序列并与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建了载有特异性锤头状核酶的贾第虫病毒重组载体pGCV634/H5/2174。该载体经线性化处理后进行体外转录,转录产物以电击方式转染对数生长期的贾第虫滋养体。提取转染后24h虫体总RNA,并以其为模板进行RT-PCR验证转染效果和对靶mRNA的切割效果。结果初步证实了该载体对虫体细胞内编码PPDK的mRNA具有切割作用。

抗HPV16 E7-ribozyme在CV-1细胞中的稳定表达

构建了由RSV-LTR启动子带动并能在细胞内稳定复制的Ribozyme的自身修剪表达质粒pRSV-Rz523、Ribozyme反义对照质粒pRSV-AE7及人增殖细胞核抗原基因(PCNA)启动子带动的HPV16 E7片段(+554～+686)的真核表达质粒pPCNA-E7。经G418抗性筛选获得了稳定表达Ribozyme的CV-1细胞克隆,其表达水平约为9.0pmol/10~6个细胞,其中活性Ribozyme的量大于50fmol/10~6个细胞,分离得到的Ribozyme可在体外特异切割E7靶RNA片段。通过共转染Ribozyme(或反义对照)和底物表达质粒并筛选出细胞克隆,研究了Ribozyme在细胞中对底物表达水平的影响。初步结果显示,Ribozyme的导入可使细胞内底物E7的RNA表达水平降低了90％(反义对照使E7 RNA表达降低20％)。上述结果提示:在CV-1细胞中表达的Ribozyme不仅在体外,同时在细胞内具有一定的生物学活性,有可能应用于逆转宫颈癌细胞的恶性表型。

犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究

目的检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。方法将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme,R酶)插入犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体:短反义序列,上游及下游均为21个碱基,形成重组质粒KRzS;长反义序列,上游为288个碱基,下游为507个碱基,形成重组质粒KRzL。另设两种阴性对照,即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因,上游为324个碱基,下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1基因的反义片段而无R酶功能区)。应用荧光实时定量RT-PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1基因mRNA切割活性。结果KRzS、KRzL转录体对KRR1基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%。而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小,RT-PCR效率仅降低12.0%。TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响。结论犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割,为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据。

HOGG1基因特异性锤头状核酶表达载体的构建及其在细胞中表达的研究

目的 :设计并合成人 8-羟基鸟嘌呤 -DNA糖苷酶 (HOGG1)特异性的锤头状核酶 (hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。初步探讨其在A5 4 9细胞中的瞬时表达效应。方法 :运用计算机软件人工设计并合成核酶基因 (RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1(+)中 ,阳性重组子由BamHI和EcoRI酶切 ,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。大量抽提阳性重组子并在非脂质体转染试剂FuGENE 6的介导下引入人肺腺癌细胞株A5 4 9,RT -PCR(逆转录多聚酶链反应 )法半定量检测转染细胞中HOGG1mRNA表达的改变。结果 :经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3 .1(+)的BamHI和EcoRI酶切位点之间 ,命名为pcDNA3 .1(+) -RZ。经RT -PCR法检测到转染核酶的靶细胞中HOGG1mRNA表达下降 36 % ,与空白细胞组差异有显著性。结论 :成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在A5 4 9细胞内对靶基因HOGG1具有抑制其表达的作用。

特异性锤头状核酶对蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶mRNA的表达抑制

目的应用特异性锤头状核酶技术研究蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase)mRNA的表达抑制。方法用电击转染的方法将含有针对贾第虫丙酮酸激酶mRNA的核酶pGCV-PKH载体导入蓝氏贾第鞭毛虫滋养体细胞内(A组),同时设单纯电击转染滋养体(B组)和正常培养滋养体(C组)为对照。转染后24、48、72和96h收集各组虫体,计算滋养体浓度,绘制虫体生长曲线。提取虫体总RNA,分别采用RT-PCR和实时PCR方法检测转染后各组各时间段(24、48、72和96h)核酶mRNA和丙酮酸激酶mRNA相对含量的变化,用紫外分光光度法检测丙酮酸激酶活性。结果虫体生长曲线显示,转染96h,A组虫体的生长受到明显抑制。RT-PCR检测结果表明,A组在转染后24h即可在贾第虫滋养体细胞内检测到核酶RNA,其水平可持续至转染后96h。A组在电击转染后24和48h,丙酮酸激酶mRNA的表达量分别下降至C组的5%(5.00±0.17)和8%(8.00±0.19),相应的酶活性下降至C组的32%(32.00±0.64)和38%(38.00±0.65)。结论特异性锤头状核酶显著抑制了蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶mRNA的表达。

蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)重组载体。方法采用RNAdraw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列,将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建重组载体pGCV-PKH。将重组载体线性化体外转录产物,分别进行贾第虫细胞外、细胞内目的mRNA切割实验,采用荧光显微镜观察转染后24h的各组虫体。采用实时PCR对切割产物进行相对定量分析。结果构建了载有蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶的犬贾第虫病毒重组载体pGCV-PKH。细胞内切割实验结果表明,荧光显微镜下只有pGCV-GFP转染组虫体显示绿色荧光,pGCV-PKH转染组丙酮酸激酶mRNA的相对含量约为正常对照组的33.14%。细胞外切割实验结果表明,该组载体能在细胞外有效切割丙酮酸激酶mRNA,在设定条件下,其切割效率为58.5%。结论重组载体pGCV-PKH能有效转染蓝氏贾第鞭毛虫细胞,并能在其细胞内外对丙酮酸激酶mRNA进行有效切割。

蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体。方法采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G∶C比例和锤头状核酶设计原则,选取合适的核酶切割靶点,设计特异性锤头状核酶(H8)序列,并将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,获得α-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体(pGCV634/H8/1423)。将载体线性化体外转录产物电击转染至贾第虫滋养体细胞内。提取转染后24 h的各组虫体总RNA,并以其为模板采用RT-PCR验证转染效果及对靶mRNA的切割效果。结果成功设计、合成了蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素mRNA锤头状核酶序列(H8),将其与犬贾第虫病毒载体(GCV)连接,成功构建了pGCV634/H8/1423;RT-PCR实验结果表明,重组载体pGCV634/H8/1423转染贾第虫细胞后24 h可检测到核酶RNA的存在,并实现了对α-8贾第素mRNA高效、特异的切割作用。结论构建的pGCV634/H8/1423能有效转染至贾第虫细胞内,并在其细胞内对α-8贾第素基因的mRNA具有高效、特异的切割作用。

抗HIF-1αmRNA锤头状核酶设计及其基因克隆

目的 设计一个抗缺氧诱导因子 1α(HIF - 1α)mRNA的锤头状核酶 ,并构建它的基因表达载体 ,以便用于肿瘤的基因治疗。方法 用RNA结构分析软件预测HIF - 1αmRNA的二级结构并选择合适的核酶作用靶点 ,以选定的靶点设计相应的锤头状核酶 ,合成编码核酶的DNA并克隆到载体pSP72上 ,酶切及DNA测序鉴定核酶序列。结果 HIF - 1αmRNA的 72位含有GUC三联体 ,可以作为核酶的切割靶点 ,设计的核酶包括 2 2nt的催化活性中心和 16nt的侧翼序列。计算机辅助预测证明此位点为合适的靶点 ,限制性内切酶和DNA测序证实核酶基因正确插入载体pSP72上。结论 成功设计并构建抗HIF - 1αmRNA锤头状核酶基因表达载体 ,为进一步运用核酶切割HIF - 1αmRNA基因 ,从而抑制肿瘤生长提供了必要条件。

锤头状核酶RCP对HBV的P基因体外转录物的作用

本文根据Ｈａｓｅｌｏｆｆ和Ｇｅｒｌａｃｈ发表的锤头状核酶结构，设计合成了针对ＨＢＶａｙｗ株Ｐ基因５＇－端２３６０位点（ＧＵＣ）的核酶ＲＣＰ，其作用底物为ＨＰＶａｙｗＰ基因的翻译起始区（２１４０－２４２２区段），运用基因克隆结合体外转录的方法，评价了ＲＣＰ的切割活性，结果表明，ＲＣＰ在体外成功地切割了长为３４０个核苷酸的靶ＲＮＡ分子，这一工作为我们进一步在细胞内评价ＲＣＰ抑制ＨＢＶ全基因组复制及其基因表达的研究创造了条件。

锤头状核酶RCP在HepG 2215细胞中阻断HBV基因表达的初步研究

目的：在细胞水平上观察核酶对ＨＢＶ基因表达的作用。方法：将在体外具有切割活性的核酶ＲＣＰ的基因构建在表达载体ｐＳＶＬ中，获得重组质粒ＲＣＰ／ｐＳＶＬ，运用脂质体介导的基因转染技术将重组核酶基因引入ＨｅｐＧ２２１５细胞，并以空载体ｐＳＶＬ转染组为对照，通过固相放射免疫测定方法检测细胞培养上清的ＨＢｓＡｇ及ＨＢｅＡｇ分泌量，以此观察核酶ＲＣＰ对ＨＢＶ基因表达的影响。结果：在暂时性表达系统中，针对Ｐ基因５＇－端２３６０位点的核酶ＲＣＰ对ＨｅｐＧ２２１５细胞中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ分泌量的抑制率分别是２６．７％、２４．８％。结论：锤头状核酶ＲＣＰ在细胞水平上能一定程度抑制ＨＢＶ基因的表达。

SjESG-2A锤头状核酶表达载体构建及其抗日本血吸虫虫卵发育研究

目的设计并合成日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因2A(eggshell protein gene 2A,ESG-2A)的特异性锤头状核酶并构建真核表达载体。探讨其在BALB/c小鼠体内的抗日本血吸虫虫卵发育作用。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用双酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定方法鉴定阳性克隆。以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠,建立动物模型。大量抽提阳性重组子,分别在小鼠感染时、感染后2w、感染后4w,将其经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,共3次。小鼠感染6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数。ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-4的水平。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3.1(+)的XbaI和EcoR I酶切位点之间,命名为pcRz-ESG-2A。在核酶组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平呈先上升后下降;在空载体组和生理盐水组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平也呈上升趋势。核酶组免疫BALB/c小鼠能诱生减虫率25.64%和减卵率44.21%。结论成功合成SjESG-2A特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在已感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠体内具有抗日本血吸虫虫卵发育的作用。

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果 RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论 成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。

CIITA锤头状核酶的克隆及其体外活性

通过CIITA核酶抑制HeLa细胞表面MHCⅡ类分子的表达。设计并合成针对人类CIITA的核酶Rz464,通过体外转录和切割实验鉴定其活性。将Rz464亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP(pRz464),并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测MHCⅡ类抗原表达,RT-PCR检测CIITA mRNA水平。结果表明,Rz464与CIITA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带。pRz464^+HeLa细胞与对照组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时CIITA的诱导型mRNA含量明显减少。Rz464通过切割CIITA mRNA,进而阻止了后者调控的MHCⅡ类分子的表达。

锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性的影响

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na+ /H+ 交换器 (NHE) 1表达和活性、pHi的影响。方法 构建含锤头状核酶序列的 pLXSN反转录病毒重组载体 ,将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞 ,G4 18筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE 1mRNA表达、pHi和Na+ /H+ 交换活性变化。结果 与转染 pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较 ,转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE 1mRNA表达减少 ,Na+ /H+ 交换活性降低 ,同时伴有pHi降低。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE 1mRNA进行特异性切割 ,减少其表达 ,使其活性下降 ,从而诱导细胞酸化。

胆囊癌hTR锤头状核酶基因真核表达载体的构建

目的 用反转录PCR法 ,调取胆囊癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因 ,并针对其序列设计锤头状核酶切割基因序列 ,并将其构建入真核表达载体pTriEx 4内。方法 根据hTRcDNA序列 ,设计引物 ,经RT PCR法从体外培养的胆囊癌细胞内调取hTR模板区基因 ,根据其测序结果 ,合成锤头状核酶基因 ,与经相应酶切的真核表达载体连接 ,酶切鉴定重组体的正确性。结果 经RT PCR从细胞内调出 6 8bp序列 ,与hTRcDNA比较 ,与模板区域碱基序列一致。核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。结论 RT PCR法可调出胆囊癌hTR基因有效片段 ;成功构建了针对hTR模板区的核酶基因的真核表达载体 。

肝内胆管癌hTR反义RNA及锤头状核酶基因真核表达载体的构建

用反转录PCR法 ,调取肝内胆管癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因 ,并针对其序列设计反义RNA封闭基因及锤头状核酶切割基因序列 ,将其构建入真核表达载体pTriEx 4内。根据hTRcDNA序列设计引物 ,经RT PCR法从体外培养的肝内胆管癌细胞内调取hTR模板区基因 ,根据其测序结果 ,合成反义RNA基因及核酶基因 ,与经相应酶切的真核表达载体连接 ,酶切鉴定重组体的正确性。经RT PCR从细胞内调出 68bp序列 ,与hTRcDNA比较 ,与模板区域碱基序列一致 ,反义RNA与核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。肝内胆管癌细胞内端粒酶的活性明显增高 ,RT PCR法可调出其hTR基因有效片段 ;