锦鲤疱疹病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

【目的】构建一种敏感性高、特异性强、重复性好的锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,为锦鲤疱疹病毒的定量检测和低浓度样品检测提供技术支持。【方法】参照靶位基因锦鲤疱疹病毒TK基因(GenBank登录号:KX609547.1)设计合成引物和探针,通过比对筛选出最佳引物探针,优化反应体系和退火温度,建立与实时荧光PCR方法的线性关系,并分析该方法的敏感性、特异性、重复性,最后应用于临床样品检测。【结果】当引物、探针浓度分别为900、300 nmol/L且退火温度为57℃时,建立的KHVddPCR扩增反应效率最高,阴阳性微滴分布界限最为明显。KHVddPCR敏感性强,检测限低至0.46拷贝/μL,在0~8.1×10^(4)拷贝/μL范围内,与实时荧光PCR检测结果的线性关系较佳(R2=0.9949)。检测变异系数低,批内变异系数为2.70%,批间变异系数为3.02%。与鲤浮肿病毒、鲫造血器官坏死病毒、真鲷虹彩病毒、草鱼出血病毒、罗非鱼湖病毒、十足目虹彩病毒、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)和诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他8种常见的水生动物疫病阳性样品无非特异性反应。在88份的临床样品检测中,阳性2份,阳性检出率为2.27%;在8份能力验证样品检测中,5份阳性,与能力验证满意结果一致,与实时荧光PCR方法和套式PCR方法检测结果一致。【结论】建立的锦鲤疱疹病毒ddPCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,可定量检测锦鲤疱疹病毒DNA,为锦鲤疱疹病毒的研究提供参考。

锦鲤疱疹病毒RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据RAA引物设计原则,以KHV Sph基因保守区为靶位点,设计5对引物并筛选出5号引物作为最优引物,在其下游引物、探针的5'端分别标记Biotin、FAM荧光基因。采用方阵法对RAA反应时间和温度等条件优化,结果显示,该检测方法在34℃~40℃恒温反应10 min即可实现对KHV目的基因片段的有效扩增,并且扩增产物结果可直接观察,由此初步建立了KHV的RAA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,建立的RAA-LFD检测方法与鲤浮肿病毒(CEV)、鲫造血器官坏死病毒(CHNV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)等常见水生动物病原核酸均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品p EASY-KHV的检测限为50拷贝/μL,与行业标准常规PCR的敏感性相当。重复性试验结果显示,该方法对5份p EASY-KHV的检测结果均一致;对室温放置7 d的p EASY-KHV检测结果也均一致。采用该方法和常规PCR对60份临床样品检测,结果显示二者的阴性、阳性符合率以及总符合率均为100%。本研究首次建立了用于检测KHV的RAA-LFD方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作方便,可用于KHV的临床样品检测,为KHV现地检测提供了一种简便、快捷的技术手段。

锦鲤疱疹病毒病的防治方法

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒引起的一种传染性疾病,主要可引起各生长阶段鲤鱼、框镜鲤、锦鲤等鳃坏死及间质性肾炎,死亡率60%~100%,一旦发病,疫情难以控制。目前,尚无药物或疫苗能够有效治疗锦鲤疱疹病毒病,只能通过综合防治和科学管理的手段加强预防,在发现疫病后及时上报并进行无害化处理和病原溯源、切断传播途径。

锦鲤疱疹病毒病(KHVD)的诊断与防控

锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）是严重威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种世界性疾病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的疾病。此病于1998年在以色列首次发生,目前已在欧洲大陆、澳洲、美国、日本、南非、中国等二十多个国家和地区暴发流行并造成严重经济损失。

锦鲤疱疹病毒的检测与人工感染试验

基于在美国和以色列普通鲤鱼和锦鲤中分离了一种新的疱疹病毒,命名为锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤鱼肾炎鳃坏死病毒(CNGV).本文根据GenBank登记的KHV序列设计了两对特异性引物,在我国患病的锦鲤样品中检测到该类病毒DNA.经对PCR产物进行克隆测序,结果表明与GenBank登记序列完全一致.用组织匀浆上清人工感染健康锦鲤,并从试验感染鱼组织中检测到KHV病毒DNA.该结果表明KHV或CNGV已经传播到我国,应引起重视.

锦鲤疱疹病毒潜伏感染实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异和敏感的检测锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)潜伏感染的方法,以KHV Sph基因为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立Real–Time PCR检测方法,并且对该方法进行特异性和敏感性评估及临床样品应用研究。结果显示:建立的方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鲡疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为42拷贝/μL,灵敏度高。用本方法对63份临床样品进行检测,有锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病史的18份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;从有临床症状的鱼中得到的15份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;30份无任何临床症状鱼中的6份被检测为阳性,阳性率为20%。本试验中建立的水生动物疱疹病毒潜伏感染快速检测方法,可为潜伏感染KHV的临床检测提供一种快速、敏感和特异的检测手段,可为KHVD的分子流行病学调查和预防提供参考。

一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定

本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHVORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj。基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近。将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%。表明本研究在国内首次分离到KHV。

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。

锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列(GenBank AB182940),利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为:Ct=-3.45 lgX+42.73(相关系数R2=0.989)。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸;预测ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404;疏水性大于亲水性;信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸);有4个跨膜区;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不存在N-糖基化位点、存在6个O-糖基化位点和11个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支。

锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白(KHV-MEP)的功能及锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤(Cyprinus carpio Koi)肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因(AB178537)的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点(PI)为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测。通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测。结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性。因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验。

锦鲤疱疹病毒病简述

锦鲤疱疹病毒病是一种危害严重,尚无有效治疗方法的高致病性传染病。本文汇集大量科研成果,从病原学、流行病学、病理学三个角度对该病毒的特性进行简述,在此基础上,推荐了实验室检测技术,提出了防控建议。

锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速有效的锦鲤疱疹病毒病检疫方法,根据锦鲤疱疹病毒(KHV)聚合酶基因(Sph)的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针,建立了一种快速检测锦鲤疱疹病毒病荧光PCR方法。用建立的检测方法对细胞培养物进行检测,并与常规PCR对比,结果荧光PCR灵敏度高于普通PCR,能检出的最低拷贝数为1.6×102/μL。应用该方法对样品进行检测,结果表明:所建立的荧光PCR检测方法4 h内可报告检测结果。该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等特点,适用于锦鲤疱疹病毒的快速检疫。

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF59的克隆、分析及其主要B细胞表位区的原核表达

从感染锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)的锦鲤(Cyprinus carpiokoi)肾脏组织中提取DNA,通过PCR扩增了KHVORF59基因。该基因全长411bp,所编码的蛋白包含136个氨基酸,分子量14.3kDa,等电点(PI)6.91,有12个潜在的O糖基化位点。此研究克隆的KHVORF59基因第130位碱基由G突变为A,使其编码的第44位氨基酸由Ala突变为Thr。采用DNAStar程序,在综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性和抗原性指数的基础上,预测了KHVORF59蛋白主要B细胞表位,并将其区段的编码序列与KHVORF59完整编码序列分别克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET32a-ORF59S和pET32a-ORF59C,转入大肠杆菌Rosetta菌株,IPTG诱导表达。SDS-PAGE及WesternBlot分析显示,pET32a-ORF59S可以高效表达,表达的截短KHVORF59蛋白主要以可溶性形式存在,采用HisBindResin填料,层析纯化了该截短蛋白。

锦鲤疱疹病毒减毒株的筛选及免疫原性研究

为了致弱锦鲤疱疹病毒得到减毒株,试验采用细叶桉叶的提取液与病毒在细胞中共培养来致弱病毒,并以中和抗体试验检验弱毒株的免疫原性。结果表明:利用获得的减毒株在加强免疫42天时,抗锦鲤疱疹病毒中和抗体效价达到最高水平,同时灭活病毒免疫组的抗锦鲤疱疹病毒中和抗体水平低于KHV-P_(52)免疫组,PBS对照组未检测出抗锦鲤疱疹病毒的中和抗体,两个免疫组与对照组比较差异显著(P<0.05);KHV-P52免疫组对鲤鱼的免疫保护效果好,免疫保护率为100%。说明细叶桉叶提取液能有效致弱锦鲤疱疹病毒,通过试验获得了一株锦鲤疱疹病毒弱毒株。

锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定

根据锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)的基因序列合成了2对引物,对送检的发病锦鲤样品提取DNA进行PCR检测,分别扩增出KHV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(thymidine kinase,TK)409 bp和AF411803基因序列484 bp的条带,对484 bp的PCR扩增产物经限制性内切酶TaqⅠ和AluⅠ酶切,分别得到200 bp/284 bp和185 bp/299 bp的片段,484 bp的PCR扩增产物的测序结果与GenBank上已发表的KHV序列一致。结果显示发病锦鲤为KHV阳性。

锦鲤疱疹病毒双基因检测方法的研究

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)双基因检测方法,本研究根据KHV聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)的保守序列设计2对引物,建立两基因同时检测的PCR方法。结果表明,利用双基因同时检测KHV,可以同时特异扩增出570 bp和155 bp片段,而与鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼疱疹病毒无扩增反应。而且所建立的双基因检测方法对临床样品的检测结果与单一PCR方法比较符合率为100%。为进一步研究KHV以及诊断方法奠定了基础。

锦鲤疱疹病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速检测锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据Gen Bank中登录的CyHV-3 Sphi基因编码区序列设计了LAMP特异性引物,经反应体系和反应条件优化,建立了检测CyHV-3的LAMP方法。结果表明,本研究建立的LAMP检测方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鱼疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为13.9拷贝/μL,灵敏度高。使用LAMP方法和普通PCR方法对四川地区的15个检测点采用鱼鳃拭子非致死性采集的临床样品进行检测,阳性检出率均为31.40%(27/86)。表明本实验建立的该检测方法具有高灵敏度、高特异性、快速和简便的特性,适用于临床上对锦鲤疱疹病毒病的快速诊断。

一例冰下低温爆发的锦鲤疱疹病毒病的鉴定

2013年4月初低温下，吉林省白山地区某网箱养殖场鲤（Cyprinus carpioL．）大量死亡，病死鲤无明显临床病变。采用PCR扩增技术检测了这些病鱼，结果表明，该低温爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病（KHVD）。这种病常爆发在水温为18-28℃的春秋季，冰下爆发还未有报道。本次锦鲤疱疹病毒病的鉴定，对于锦鲤疱疹病毒感染鲤温度条件的变化和疾病的预防提供了参考。