镁离子转运蛋白1在脓毒症患者外周血CD8^(+)T淋巴细胞中的表达及其意义

目的:探讨镁离子转运蛋白1(MagT1)在脓毒症患者外周血CD8^(+)T淋巴细胞中的表达水平及其作用。方法:收集2018年3月至2021年5月于东莞市滨海湾中心医院就诊的96例脓毒症患者资料,根据感染及循环衰竭程度将脓毒症患者分为普通脓毒症组(n=39)、严重脓毒症组(n=33)和脓毒性休克组(n=24),另取同期健康者为对照组(n=30)。分离培养各组患者外周血CD8^(+)T细胞,检测外周血和CD8^(+)T细胞中Mg^(2+)浓度;qRT-PCR检测CD8^(+)T细胞中多种Mg^(2+)转运体(TRPM7、TRPM6、Mrs2p、SLC41A1、SLC41A2、MagT1及ACDP2)mRNA表达水平;Western blot检测CD8^(+)T细胞中MagT1表达水平;流式细胞术检测CD8^(+)T细胞表面抑制受体PD-1、Tim-3和活化受体NKG2D、HLA-DR表达水平;Pearson相关性分析MagT1与PD-1、Tim-3、NKG2D及HLA-DR表达水平相关性。结果:与对照组比较,脓毒症患者CD8^(+)T细胞中Mg^(2+)浓度显著降低(P<0.05),且病情越重,浓度越低,而外周血中Mg^(2+)浓度差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,脓毒症患者CD8^(+)T细胞中仅MagT1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),而其他6种Mg^(2+)转运体mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,脓毒症患者CD8^(+)T细胞中MagT1表达水平也显著降低(P<0.05),且其细胞表面抑制分子PD-1和Tim-3表达水平显著增加(P<0.05),而活化分子NKG2D和HLA-DR表达水平显著降低(P<0.05)。Pearson相关分析显示,MagT1与PD-1和Tim-3呈显著负相关,而与NKG2D和HLA-DR呈显著正相关(P<0.05)。结论:MagT1在脓毒症患者CD8^(+)T细胞中低表达,且通过降低胞内Mg^(2+)浓度,调控CD8^(+)T细胞表面分子表达,导致脓毒症患者CD8^(+)T细胞耗竭。

慢性HBV感染者外周血单个核细胞中miR-194-5p和MagT1表达水平检测及其意义

目的:检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中miR-194-5p和镁离子(Mg2+)转运蛋白1(MagT1)表达水平,阐明其可能的临床意义。方法:收集40例健康体检者(健康对照组)、40例HBV携带者(HBV携带组)、40例轻中度慢性乙型肝炎(轻中度CHB组)和40例重度慢性乙型肝炎(重度CHB组)患者的临床资料。采集各组研究对象外周血并利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs,采用RT-PCR法检测各组研究对象PBMCs中miR-194-5p及MagT1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组研究对象PBMCs中MagT1蛋白表达水平,检测各组研究对象外周血和PBMCs中Mg+水平,流式细胞术检测各组研究对象PBMCs中CD8+T淋巴细胞表面分子程序性死亡受体1(PD-1)和自然杀伤细胞受体2群D分子(NKG2D)表达水平。在293T细胞中分别转染miR-194-5p mimic质粒(miR-194-5p mimic组)和miR-NC质粒(miR-NC组),应用双荧光素酶报告基因实验检测2组293T细胞中荧光素酶活性。结果:与健康对照组比较,HBV携带组、轻中度CHB组和重度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg2+水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平均明显降低(P<0.05),miR-194-5p mRNA及CD8+T淋巴细胞表面分子PD-1表达水平升高(P<0.05)。与HBV携带组和轻中度CHB组比较,重度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg2+水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平均降低(P<0.05),miR-194-5p mRNA及CD8+T细胞表面分子PD-1表达水平降低(P<0.05)。与HBV携带组比较,轻中度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg2+水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平降低(P<0.05),miR-194-5p mRNA及CD8+T淋巴细胞表面分子PD-1表达水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验,MagT1是miR-194-5p靶基因。结论:miR-194-5p可能通过靶向下调MagT1表达,引起MagT1介导的Mg2+内流障碍,造成CD8+T淋巴细胞免疫活性降低,导致乙型肝炎慢性发展。

靶向MagT1的siRNA对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究小干扰RNA(siRNA)沉默镁离子转运蛋白1(MagT1)的表达对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖和凋亡的影响。方法将MCF-7细胞分为MagT1siRNA实验组(A组)、siRNA阴性对照组(B组)和空白细胞对照组(C组)。采用RT-PCR和Western blot法分别检测MagT1mRNA和蛋白表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡和半胱天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)表达情况。结果与B组和C组相比,A组MagT1mRNA和蛋白表达降低,Caspase-9表达增加,细胞增殖率降低,细胞凋亡率增加(P<0.05)。结论沉默MagT1表达能抑制乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡;线粒体信号转导途径参与了细胞凋亡过程。

沉默MagT1影响大鼠心肌细胞内Mg^(2+)水平和细胞凋亡的研究

目的使用siRNA沉默大鼠心肌细胞的镁离子转运蛋白1(MagT1),检测细胞内Mg^(2+)浓度变化和细胞凋亡情况。方法设计并合成MagT1siRNA序列,转入原代培养大鼠心肌细胞沉默MagT1,使用反转录PCR和Western blot检测MagT1mRNA和蛋白表达情况,荧光显微镜检测细胞内Mg^(2+)浓度变化情况,流式细胞法检测细胞凋亡情况。结果相比阴性siRNA组,MagT1siRNA转染大鼠心肌细胞48h,MagT1mRNA的沉默效率为51.83%(P<0.05),MagT1蛋白的沉默效率为56.75%(P<0.05),胞内Mg^(2+)浓度降低29.13%(P<0.05),细胞凋亡率为31.18%(P<0.01);转染60h,MagT1mRNA的沉默效率为86.91%(P<0.01),MagT1蛋白质的沉默效率为83.85%(P<0.01),细胞内Mg^(2+)浓度降低41.32%(P<0.01),细胞凋亡率为40.61%(P<0.01)。结论 MagT1被显著沉默后,细胞内Mg^(2+)浓度显著降低,细胞凋亡显著提高,细胞生命活动受到较大影响。

慢性HBV感染中MagT1调节活化T细胞功能的分子机制研究

目的研究慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染中MagT1调节活化T细胞功能的分子机制。方法①筛选HBV-DNA持续阳性超过6个月,检测值大于1.0×10~5IU/ml,且排除其它病毒感染、肝炎、肝硬化的慢性HBV感染患者5例,同时随机选取正常人5例。②采集患者外周血,分离单个核细胞,用γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、CD3抗体、白细胞介素1α(interleukin 1 alpha,IL-1α)活化T细胞;流式细胞仪检测T细胞活化标志物CD25,比较HBV感染组与正常组T细胞的活化能力。③构建包装镁离子转运蛋白1(magnesium transporter 1,MagT1)过表达和MagT1-shRNA慢病毒,分别感染两组T细胞,以流式细胞仪法检测各组T细胞周期的变化,western blot法检测MagT1蛋白及通道蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated-PI3K,p-PI3K)、雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化雷帕霉素(phosphorylated-mTOR,p-mTOR)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-Akt,p-Akt)的水平。结果流式细胞仪检测表明T细胞活化后,正常组、HBV感染组T细胞活化后CD25^+T细胞阳性率分别由(15.4±1.37)%、(6.56±1.66)%上升为(66.62±1.52)%、(30.63±1.83)%。同时流式细胞仪检测表明HBV感染组对照与正常组对照相比,T细胞阻滞于G0/G1期(P<0.01),而上调MagT1可以修复HBV感染患者阻滞的T细胞周期,从而恢复T细胞的增殖能力。Western blot表明慢性HBV感染组对照MagT1低于正常组对照(P<0.01),PI3K、mTOR和Akt表达差异两组无统计学意义(P>0.05),但p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著下降(P均<0.05)。上调MagT1后,正常组、HBV感染组PI3K、mTOR和Akt表达没有明显变化(P>0.05),但p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著升高,且正常组高于HBV感染组(P<0.05)。下调MagT1后,正常组、HBV感染组PI3K、mTOR和Akt表达没有明显变化(P>0.05),但p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著下降,且HBV感染组低于正常组(P<0.05)。结论 HBV感染组较正常组在T细胞活化后MagT1蛋白表达降低,T细胞的增殖能力和活化程度减弱,主要阻滞于G0/G1期。其机制与PI3K、mTOR和Akt磷酸化水平降低,使mTOR信号通路受到抑制有关。过表达MagT1表达可以升高PI3K、mTOR和Akt磷酸化水平,重新激活mTOR信号通路,提高T细胞增殖能力和活化程度,从而逆转T细胞功能耗竭。