大蕉果皮脱镁螯合酶的纯化和某些特性初探

用盐析法从大蕉果皮中初步纯化了脱镁螯合酶(Mg-dechelatase,MDCase),纯化程度约为3.01倍。以叶绿酸(chlorophyllin)为底物,MDCase K_m值为13.47 nmol·L^(-1);活性最适反应温度为50℃;在30～70℃内,活性较稳定,但在100℃下40 min仍保持50%活性;在pH 6.5～9.5范围内,随着pH的升高,酶活性逐渐增大。MDCase活性受还原剂β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、抗坏血酸、Na_2SO_3(SO_2)和还原型谷胱甘肽的抑制,而受过氧化氢激活;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)、Fe^(2+)、Ca^(2+)和K^+都在不同程度上抑制MDcase活性;不同的螯合剂效应不同,EDTA对酶活性有抑制作用,而柠檬酸却影响不大。

镁螯合酶的结构与功能

镁螯合酶(magnesium chelatase)是叶绿素合成过程中的关键酶,催化原卟啉IX与Mg2+螯合形成镁原卟啉IX。镁螯合酶由催化亚基H与AAA+亚基I、D组成。通过这3种亚基的协调配合,在ATP驱动下实现Mg2+与原卟啉IX的螯合,推动叶绿素的合成。在这一过程中,基因组解偶联基因4(GUN4)蛋白对其发挥重要的正调控作用。自上世纪90年代以来,镁螯合酶独特的结构及其作用机制一直吸引着研究者们的兴趣。本文结合最新的研究进展,阐述镁螯合酶的结构、酶促反应动力学及其催化机制等。另外,对于GUN4蛋白对镁螯合酶的调控也进行了概述。

镁离子螯合酶在植物生长发育中的调控作用

镁离子螯合酶是叶绿素合成中起关键作用的酶,除了催化叶绿素的合成,还参与了植物生长发育过程中其他代谢。根据已有研究报道,对镁离子螯合酶及其各组分在叶绿素生物合成中的功能,镁离子螯合酶在脱落酸信号转导、质体到核反向信号转导及活性氧代谢中发挥的作用等进行了介绍,并分析了目前研究所存在的问题,展望了镁离子螯合酶相关研究前景。

利用酵母双杂交筛选豌豆叶绿体镁离子螯合酶D亚基相互作用蛋白

植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中,形成镁原卟啉IX.镁离子螯合酶是1个由3个亚基H、D和I组成的多亚基酶,3个亚基均由细胞核编码,进入叶绿体发挥功能.该酶不仅控制着叶绿素的合成,其各个亚基还具有很多其它的功能:H亚基既是ABA受体,又参与叶绿体到细胞核的反向信号传导;D亚基也与叶绿体到细胞核的反向信号传导有关.本文利用酵母双杂交技术,将编码豌豆镁离子螯合酶D亚基的cDNA片段构建到诱饵载体pGBKT7中,分别用共转化的方法筛选豌豆叶片细胞核编码的均一化cDNA文库和用Mating的方法筛选豌豆叶片叶绿体编码的均一化cDNA文库,共得到121个候选克隆,其中有60个克隆共编码21个叶绿体蛋白质,19个来自于核基因编码,2个来自于叶绿体基因编码.这些候选蛋白参与叶绿素合成、卡尔文循环、叶绿体蛋白质翻译和叶绿体基因转录等多个代谢过程.酵母点对点和GST-pull down对其中的4个蛋白做了进一步的验证.这些结果将为D亚基的功能研究提供进一步的线索.

水稻镁离子螯合酶调控蛋白Gun4羧基末端的功能分析

植物叶绿素生物合成途径(镁分支)中的第一个酶是镁离子螯合酶,它由I(ChlI)、D(ChlD)和H(ChlH)三个亚基组成.各亚基不仅参与叶绿素的生物合成,而且还与叶绿体到细胞核的反向信号传导有关.Gun4是一个卟啉结合蛋白,它能提高植物镁离子螯合酶的活性,在缺乏Gun4的条件下,镁离子螯合酶整个复合物非常不稳定,不足以开始催化反应.我们以前的研究发现,Gun4的C末端几个氨基酸具有重要作用.在本文中,通过缺失突变,获得了C端缺失了8个氨基酸残基突变的Gun4(Gun4L).酵母双杂交与GST-pull down实验发现,Gun4L仍能与H亚基相互作用,原核表达和纯化Gun4L和镁离子螯合酶各亚基后,重组镁离子螯合酶的酶活分析证实,Gun4L对镁离子螯合酶的活性失去了激活作用.

镁离子螯合酶活性调控及其功能

镁离子螯合酶是叶绿素合成关键酶,对光合自养生物光合作用和生长发育至关重要。本文主要综述镁离子螯合酶的活性调控及其参与的其他代谢途径,如叶绿体到细胞核反向信号转导、脱落酸信号途径以及糖代谢等通路,并展望镁离子螯合酶的相关研究前景。

采后猕猴桃叶绿素降解机制及1-MCP处理对其代谢的影响

以陕西"秦美"猕猴桃为试材,在(0.0±0.5)℃贮藏条件下,研究猕猴桃叶绿素的降解机制及1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)处理对猕猴桃叶绿素及其衍生物和相关酶活的影响。结果表明:在猕猴桃果实贮藏过程中,脱植基叶绿素a、脱镁叶绿素a和脱镁叶绿酸a是叶绿素a的主要降解产物,其含量呈先上升后下降的趋势。脱植基叶绿素a和脱镁叶绿酸a的变化趋势分别与叶绿素酶和脱镁螯合酶活性变化趋势一致,由此推断其降解过程遵循叶绿素脱镁叶绿酸a加氧酶降解途径。1.0 μL/L 1-MCP处理可提高猕猴桃果实过氧化物酶活性,抑制叶绿素酶和脱镁螯合酶的活性,减缓叶绿素的降解,抑制脱植基叶绿素a、脱镁叶绿素a、脱镁叶绿酸a的生成,从而延缓果实绿色的降解以及果实的成熟与衰老。研究结果可为1-MCP延缓猕猴桃果实的褪色提供理论依据。

水稻淡绿叶突变体HM133的遗传分析与基因定位

EMS诱导籼稻品种IR64获得淡绿叶突变体HM133。与野生型IR64相比,HM133播种后的第6周和第15周的光合色素含量以及抽穗期的净光合速率显著降低,气孔导度则明显上升;此外,突变体株高、每穗实粒数和结实率等农艺性状也较野生型显著下降。叶绿体超微结构分析表明,分蘖期HM133类囊体基粒片层形状不规则,堆叠凌乱、排列疏松。遗传分析表明HM133淡绿叶性状受单隐性核基因控制。通过分子标记将该基因定位于第3染色体长臂RM143和RM3684之间。该区间内包含编码镁螯合酶D亚基的基因OsCHLD。序列分析表明HM133中该基因第10外显子上有一个从G突变为A的单碱基变异,导致编码的氨基酸由精氨酸变成谷氨酸,推测OsCHLD基因即为控制HM133淡绿叶表型的候选基因。

野生软枣猕猴桃冷藏期间生理变化与叶绿素降解相关性研究

实验对野生软枣猕猴桃冷藏期间生理变化与叶绿素降解进行了相关性分析。结果表明:野生软枣猕猴桃冷藏期间,果实质地变软的同时L*和b*不断下降,与果实显色有密切关系的叶绿素和β-胡萝卜素含量也不断下降,而类黄酮物质含量与果实色度无显著相关,叶绿素酶的活力不断降低而脱镁螯合酶的活力则是先升高后降低,叶绿素含量与叶绿素酶活性呈显著正相关。

利用CRISPR-Cas9系统敲除一个水稻镁离子螯合酶基因

结合重测序、图位克隆技术和转录组测序得到了一个水稻黄叶突变的候选基因,预测该基因是一个编码镁离子螯合酶Ⅰ亚基的未知功能基因,植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶。本研究利用CRISPR-Cas9技术,采用一步法构建该基因的pC1300-Cas9-12976重组载体。将该重组载体进行农杆菌介导的水稻遗传转化,得到T0代转基因植株的阳性,完成转基因植株中目的基因的序列分析。结果表明,T0-Cas9-12976转基因编辑率为71.4%。为进一步验证该基因的生物学功能提供了良好的依据。

CHLH的ABA受体之争

镁螯合酶H亚基是叶绿素合成关键酶之一,自2006年在拟南芥上证明CHLH为ABA受体以来,有关CHLH与ABA信号传递的关系在大麦、甜樱桃、草莓、桃等方面已有报道,但不同研究结果对CHLH是否为ABA受体仍然存有争议。全面评述CHLH与ABA信号传递的关系研究进展概况,重点介绍CHLH是否为ABA受体以及CHLH对ABA信号感知和向下游转导的研究进展。

高浓度CO_2对香蕉和大蕉后熟及果皮叶绿素降解的影响

以香蕉和大蕉为试材,在20%CO_2+21%O_2气调环境和20℃的后熟条件下,通过测定叶绿素含量、果实硬度、细胞膜透性、丙二醛含量、叶绿素酶和脱镁螯合酶活力来研究高浓度CO_2对香蕉和大蕉后熟和果皮叶绿素降解的影响。结果表明:20%CO_2对香蕉和大蕉的后熟和叶绿素b含量均无显著影响,但对叶绿素a含量的影响不同,相比于大蕉,香蕉果皮叶绿素a的降解受到明显抑制;叶绿素酶不是香蕉和大蕉叶绿素降解的关键酶;20%CO_2明显抑制了香蕉脱镁螯合酶的活力,但大蕉脱镁螯合酶的活力反而提高,脱镁螯合酶是香蕉叶绿素降解过程中的关键酶。可见,相比于大蕉,香蕉果皮的褪绿更容易受到高浓度CO_2的贮藏环境的影响。

二倍体草莓匍匐茎遗传转化体系的建立

【目的】为了建立一种可行的草莓稳定遗传转化体系。【方法】以二倍体草莓(Fragaria vesca,‘Hawaii-4’)匍匐茎的茎段为外植体,利用农杆菌介导法进行侵染,并对农杆菌侵染液的浓度、真空渗透时间、暗培养时间和抗生素浓度对草莓茎段转化体系进行了探讨。【结果】以镁离子螯合酶H亚基为操纵基因研究表明,农杆菌侵染液浓度OD600=1,真空渗透时间20 min,暗培养3 d,卡那霉素筛选浓度为35 mg/L为二倍体草莓匍匐茎茎段的最佳遗传转化条件,转化效率达到8%以上。【结论】利用草莓匍匐茎为外植体建立了一种稳定有效的遗传转化转基因体系,为今后草莓的基因改良提供技术支撑。