miR-124靶向镁转运蛋白1调控活化后人T细胞功能耗竭

目的研究miR-124靶向镁转运蛋白1(MagT1)可否调控活化后T细胞功能耗竭。方法1)分离外周血单个核细胞,用IFN-γ、IL-2、抗-CD3抗体、抗-CD28抗体和IL-1α活化T细胞;流式细胞仪检测T细胞活化标记分子CD25和CD69所占的比例。2)构建miR-124/miR-124 sponge慢病毒载体;包装慢病毒后感染活化T细胞,用RT-qPCR检测感染后T细胞内miR-124和MagT1基因表达。3)生物信息学分析miR-124与MagT1的靶向位点,并用双荧光素酶报告基因系统鉴定。4)Western blot法检测慢病毒感染前后T细胞MagT1和PD-1蛋白水平。5)CCK8法检测慢病毒感染前后T细胞增殖能力;ELISA法检测细胞T分泌细胞因子TNF-α和TGF-β的能力。结果流式细胞仪检测表明T细胞活化成功。RT-qPCR检测表明慢病毒构建成功,miR-124/miR-124 sponge载体分别显著上调或下调miR-124的表达(P<0.01)。双荧光素酶报告基因系统证实miR-124靶向MagT1 3′UTR并抑制其表达。Western blot表明miR-124过表达组MagT1蛋白水平低于对照组(P<0.05),PD-1蛋白水平高于对照组(P<0.05),抑制miR-124后,MagT1蛋白水平高于对照组(P<0.05),PD-1蛋白水平低于对照组(P<0.05)。miR-124过表达使T细胞增殖能力和分泌TNF-α能力显著降低,而抑制miR-124使T细胞增殖能力和分泌TGF-β能力显著升高(P<0.01)。结论miR-124可以负向调节靶基因MagT1的表达,并对活化后T细胞功能耗竭具有重要的调节作用。

镁离子激活自噬促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体外实验观察

目的:探讨镁离子对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化的影响及其相关的机制。方法:以成骨诱导培养液(含镁离子0.8 mmol/L)为对照组,在此培养液中依次添加100、200、400μmol/L镁离子作为实验组(Mg 100、200、400μmol/L组)。培养大鼠BMSCs,应用MTT法检测镁离子对细胞代谢活性的影响,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和对-硝基苯磷酸盐法检测细胞ALP蛋白的表达,茜素红染色和半定量分析检测细胞外基质钙盐的沉积情况,实时荧光定量分析检测ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥素(osteopontin,OPN)、BMP-2及镁转运蛋白1(MagT1)基因的相对表达量,激光共聚焦观察OCN、LC3蛋白的表达水平,Western Blot检测OCN蛋白、自噬相关蛋白的表达水平,自噬双标腺病毒转染观察细胞自噬流情况,荧光素酶法检测细胞内ATP浓度。结果:1、4、7 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L对大鼠BMSCs的增殖活性无显著影响(P>0.05);实验组Mg 100、200、400μmol/L ALP染色和茜素红染色较对照组深染,ALP蛋白分泌和ARS基质矿化均较对照组增加,其中Mg 100μmol/L组较对照组有显著性差异(P<0.01);7 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L的ALP、OCN、OPN、BMP-2和MagT1基因相对表达均较对照组上调,其中Mg 200μmol/L组表达量最高(P<0.01);4 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L OCN蛋白免疫荧光染色较对照组均有一定程度增强,其中Mg 200μmol/L组OCN蛋白荧光染色最强;Mg 200μmol/L组LC3蛋白荧光染色增强,呈斑点状分布;4 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L OCN和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达提高,Mg 200μmol/L组的蛋白条带染色最深、灰度值比最高。1 d时,AdPlus-mCherry-GFP-LC3B转染后Mg 200μmol/L组双荧光共表达成斑点状分布;3、6 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L细胞内ATP浓度较对照组均下降,且差异具有统计学意义(P<0.01),其中Mg 400μmol/L组的细胞内ATP水平最低。结论:生理范围内镁离子浓度增加对BMSCs增殖活性无显著影响,可以提高BMSCs成骨分化、矿化性能,其作用可能与MagT1的表达上调、细胞内ATP水平下降和自噬激活相关。

慢性HBV感染者外周血单个核细胞中miR-194-5p和MagT1表达水平检测及其意义

目的:检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中miR-194-5p和镁离子(Mg2+)转运蛋白1(MagT1)表达水平,阐明其可能的临床意义。方法:收集40例健康体检者(健康对照组)、40例HBV携带者(HBV携带组)、40例轻中度慢性乙型肝炎(轻中度CHB组)和40例重度慢性乙型肝炎(重度CHB组)患者的临床资料。采集各组研究对象外周血并利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs,采用RT-PCR法检测各组研究对象PBMCs中miR-194-5p及MagT1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组研究对象PBMCs中MagT1蛋白表达水平,检测各组研究对象外周血和PBMCs中Mg+水平,流式细胞术检测各组研究对象PBMCs中CD8+T淋巴细胞表面分子程序性死亡受体1(PD-1)和自然杀伤细胞受体2群D分子(NKG2D)表达水平。在293T细胞中分别转染miR-194-5p mimic质粒(miR-194-5p mimic组)和miR-NC质粒(miR-NC组),应用双荧光素酶报告基因实验检测2组293T细胞中荧光素酶活性。结果:与健康对照组比较,HBV携带组、轻中度CHB组和重度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg2+水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平均明显降低(P<0.05),miR-194-5p mRNA及CD8+T淋巴细胞表面分子PD-1表达水平升高(P<0.05)。与HBV携带组和轻中度CHB组比较,重度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg2+水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平均降低(P<0.05),miR-194-5p mRNA及CD8+T细胞表面分子PD-1表达水平降低(P<0.05)。与HBV携带组比较,轻中度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg2+水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平降低(P<0.05),miR-194-5p mRNA及CD8+T淋巴细胞表面分子PD-1表达水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验,MagT1是miR-194-5p靶基因。结论:miR-194-5p可能通过靶向下调MagT1表达,引起MagT1介导的Mg2+内流障碍,造成CD8+T淋巴细胞免疫活性降低,导致乙型肝炎慢性发展。

镁离子转运蛋白1在脓毒症患者外周血CD8^(+)T淋巴细胞中的表达及其意义

目的:探讨镁离子转运蛋白1(MagT1)在脓毒症患者外周血CD8^(+)T淋巴细胞中的表达水平及其作用。方法:收集2018年3月至2021年5月于东莞市滨海湾中心医院就诊的96例脓毒症患者资料,根据感染及循环衰竭程度将脓毒症患者分为普通脓毒症组(n=39)、严重脓毒症组(n=33)和脓毒性休克组(n=24),另取同期健康者为对照组(n=30)。分离培养各组患者外周血CD8^(+)T细胞,检测外周血和CD8^(+)T细胞中Mg^(2+)浓度;qRT-PCR检测CD8^(+)T细胞中多种Mg^(2+)转运体(TRPM7、TRPM6、Mrs2p、SLC41A1、SLC41A2、MagT1及ACDP2)mRNA表达水平;Western blot检测CD8^(+)T细胞中MagT1表达水平;流式细胞术检测CD8^(+)T细胞表面抑制受体PD-1、Tim-3和活化受体NKG2D、HLA-DR表达水平;Pearson相关性分析MagT1与PD-1、Tim-3、NKG2D及HLA-DR表达水平相关性。结果:与对照组比较,脓毒症患者CD8^(+)T细胞中Mg^(2+)浓度显著降低(P<0.05),且病情越重,浓度越低,而外周血中Mg^(2+)浓度差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,脓毒症患者CD8^(+)T细胞中仅MagT1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),而其他6种Mg^(2+)转运体mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,脓毒症患者CD8^(+)T细胞中MagT1表达水平也显著降低(P<0.05),且其细胞表面抑制分子PD-1和Tim-3表达水平显著增加(P<0.05),而活化分子NKG2D和HLA-DR表达水平显著降低(P<0.05)。Pearson相关分析显示,MagT1与PD-1和Tim-3呈显著负相关,而与NKG2D和HLA-DR呈显著正相关(P<0.05)。结论:MagT1在脓毒症患者CD8^(+)T细胞中低表达,且通过降低胞内Mg^(2+)浓度,调控CD8^(+)T细胞表面分子表达,导致脓毒症患者CD8^(+)T细胞耗竭。

miR-199a-5p靶向MagT1在慢性HBV感染中引起T细胞功能耗竭的作用机制

目的研究miR-199a-5p靶向镁离子转运蛋白1(Magnesium transporter 1,MagT1)在慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染中引起T细胞功能耗竭的分子作用机制。方法①选取经临床确诊的慢性乙型肝炎患者10例,经检测其HBV-DNA检测值持续6月达1.0×10~5 IU/ml,且排除其它类型的病毒感染、肝硬化、肝癌等,并选取体检者10例作为正常对照组。②采集患者外周血,分离单个核细胞,用γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、CD3抗体、白细胞介素1α(interleukin 1αlpha,IL-1α)活化T细胞;流式细胞仪进行T细胞亚群分析。③荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测慢性HBV感染组与正常对照组T细胞中miR-199a-5p、程序性细胞死亡因子1(programmed cell death 1,PD-1)和MagT1基因表达情况。④双荧光素酶报告基因系统鉴定miR-199a-5p与MagT1的靶向关系。⑤构建包装miR-199a-5p/miR-199a-5p sponge慢病毒载体,感染T细胞后RT-qPCR分别检测慢病毒感染后T细胞miR-199a-5p、PD-1和MagT1基因表达;⑥Western blot检测慢病毒感染T细胞前后MagT1、PD-1蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测表明慢性HBV感染组及正常对照组T细胞均活化成功。RT-qPCR检测表明慢性HBV感染组miR-199a-5p表达显著高于正常对照组(P<0.01),PD-1表达也显著高于正常对照组(P<0.01),但MagT1表达显著低于正常对照组(P<0.01)。双荧光素酶报告基因系统证实miR-199a-5p靶向MagT13’UTR并抑制其表达(P<0.05)。RT-qPCR检测表明慢病毒构建成功,miR-199a-5p/miR-199a-5p sponge分别显著上调或下调miR-199a-5p表达(P<0.01)。上调miR-199a-5p表达后,RT-qPCR表明MagT1基因表达显著低于对照组(P<0.01),PD-1基因表达显著高于对照组(P<0.01),且正常对照组均高于HBV感染组(P<0.01);Western blot表明MagT1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),PD-1蛋白水平显著升高(P<0.01),且正常对照组高于HBV感染组(P<0.01)。下调miR-199a-5p表达后,MagT1表达量显著高于对照组(P<0.05),PD-1表达量显著低于对照组(P<0.01),且HBV感染组低于正常对照组(P<0.01);Western blot表明MagT1蛋白表达水平显著升高(P<0.01),PD-1蛋白水平显著降低(P<0.01),且HBV感染组低于正常对照组(P<0.01)。结论在慢性HBV感染中,miR-199a-5p可以负向调节靶基因MagT1的表达,并对活化后T细胞功能耗竭具有重要的调节作用。

靶向MagT1的siRNA对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究小干扰RNA(siRNA)沉默镁离子转运蛋白1(MagT1)的表达对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖和凋亡的影响。方法将MCF-7细胞分为MagT1siRNA实验组(A组)、siRNA阴性对照组(B组)和空白细胞对照组(C组)。采用RT-PCR和Western blot法分别检测MagT1mRNA和蛋白表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡和半胱天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)表达情况。结果与B组和C组相比,A组MagT1mRNA和蛋白表达降低,Caspase-9表达增加,细胞增殖率降低,细胞凋亡率增加(P<0.05)。结论沉默MagT1表达能抑制乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡;线粒体信号转导途径参与了细胞凋亡过程。

沉默MagT1影响大鼠心肌细胞内Mg^(2+)水平和细胞凋亡的研究

目的使用siRNA沉默大鼠心肌细胞的镁离子转运蛋白1(MagT1),检测细胞内Mg^(2+)浓度变化和细胞凋亡情况。方法设计并合成MagT1siRNA序列,转入原代培养大鼠心肌细胞沉默MagT1,使用反转录PCR和Western blot检测MagT1mRNA和蛋白表达情况,荧光显微镜检测细胞内Mg^(2+)浓度变化情况,流式细胞法检测细胞凋亡情况。结果相比阴性siRNA组,MagT1siRNA转染大鼠心肌细胞48h,MagT1mRNA的沉默效率为51.83%(P<0.05),MagT1蛋白的沉默效率为56.75%(P<0.05),胞内Mg^(2+)浓度降低29.13%(P<0.05),细胞凋亡率为31.18%(P<0.01);转染60h,MagT1mRNA的沉默效率为86.91%(P<0.01),MagT1蛋白质的沉默效率为83.85%(P<0.01),细胞内Mg^(2+)浓度降低41.32%(P<0.01),细胞凋亡率为40.61%(P<0.01)。结论 MagT1被显著沉默后,细胞内Mg^(2+)浓度显著降低,细胞凋亡显著提高,细胞生命活动受到较大影响。

慢性HBV感染中MagT1调节活化T细胞功能的分子机制研究

目的研究慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染中MagT1调节活化T细胞功能的分子机制。方法①筛选HBV-DNA持续阳性超过6个月,检测值大于1.0×10~5IU/ml,且排除其它病毒感染、肝炎、肝硬化的慢性HBV感染患者5例,同时随机选取正常人5例。②采集患者外周血,分离单个核细胞,用γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、CD3抗体、白细胞介素1α(interleukin 1 alpha,IL-1α)活化T细胞;流式细胞仪检测T细胞活化标志物CD25,比较HBV感染组与正常组T细胞的活化能力。③构建包装镁离子转运蛋白1(magnesium transporter 1,MagT1)过表达和MagT1-shRNA慢病毒,分别感染两组T细胞,以流式细胞仪法检测各组T细胞周期的变化,western blot法检测MagT1蛋白及通道蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated-PI3K,p-PI3K)、雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化雷帕霉素(phosphorylated-mTOR,p-mTOR)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-Akt,p-Akt)的水平。结果流式细胞仪检测表明T细胞活化后,正常组、HBV感染组T细胞活化后CD25^+T细胞阳性率分别由(15.4±1.37)%、(6.56±1.66)%上升为(66.62±1.52)%、(30.63±1.83)%。同时流式细胞仪检测表明HBV感染组对照与正常组对照相比,T细胞阻滞于G0/G1期(P<0.01),而上调MagT1可以修复HBV感染患者阻滞的T细胞周期,从而恢复T细胞的增殖能力。Western blot表明慢性HBV感染组对照MagT1低于正常组对照(P<0.01),PI3K、mTOR和Akt表达差异两组无统计学意义(P>0.05),但p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著下降(P均<0.05)。上调MagT1后,正常组、HBV感染组PI3K、mTOR和Akt表达没有明显变化(P>0.05),但p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著升高,且正常组高于HBV感染组(P<0.05)。下调MagT1后,正常组、HBV感染组PI3K、mTOR和Akt表达没有明显变化(P>0.05),但p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平显著下降,且HBV感染组低于正常组(P<0.05)。结论 HBV感染组较正常组在T细胞活化后MagT1蛋白表达降低,T细胞的增殖能力和活化程度减弱,主要阻滞于G0/G1期。其机制与PI3K、mTOR和Akt磷酸化水平降低,使mTOR信号通路受到抑制有关。过表达MagT1表达可以升高PI3K、mTOR和Akt磷酸化水平,重新激活mTOR信号通路,提高T细胞增殖能力和活化程度,从而逆转T细胞功能耗竭。