无掩模定域性电沉积微镍柱工艺研究

无掩模定域性电沉积技术是一种以增材制造方式进行电化学沉积的先进制造方法。用定域性电沉积方法沉积微镍柱结构,通过实体显微镜和扫描电镜观察微镍柱沉积高度、直径及微观形貌,并根据测量结果计算平均沉积速率,设计双因素实验研究脉冲电压、电解液浓度、添加剂及电极间隙对定域性电沉积微镍柱的影响。结果表明:微镍柱平均直径及平均沉积速率随脉冲电压增大均快速增大,脉冲电压大于4.0V时微镍柱更为致密,但表面弯曲且粗细不均;不同脉冲电压下,改变电解液浓度产生的影响不同,主要影响微镍柱沉积速率及表面形貌;添加剂(PPS-OH)使微镍柱表面形貌变得光滑平整、光亮度增加,微镍柱平均直径及沉积速率随添加剂含量增大而减小;电极间隙主要影响微镍柱沉积形态及沉积速率,电极间隙大于10μm时沉积得到的微镍柱逐渐呈现圆锥状,平均沉积速率减小明显。当脉冲电压4.2V、氨基磺酸镍含量300g/L、添加剂(PPS-OH)含量0.5g/L及电极间隙10μm时,无掩模定域性电沉积得到的微镍柱形状规整、粗细均匀且表面光滑平整。

基于离子液射流定域电沉积的微镍柱成形研究

为提高定域电沉积三维金属微结构的加工效率和质量,采用离子液射流定域电沉积方式制备直径50~100μm、高度450~500μm的微镍柱,探究了工艺参数对沉积速率、微镍柱直径和微观形貌的影响。结果表明,在选定的参数范围内,微镍柱直径和沉积速率随着电压的增大同时增大,占空比对微镍柱沉积速率的影响高于对平均直径的影响,而脉冲频率对于微镍柱沉积速率影响不大。通过体式显微镜观察微镍柱微观形貌呈尖端效应,表明在阳极尖端半径对应区域和离子液射流范围内的共有区域具有电沉积定域性和优先性。合理控制阳极运动轨迹,调节参数为极间电压4.4 V、占空比50%、脉冲频率10 kHz时,可获得轮廓平直、表面致密的直径为61μm微镍柱。

工艺参数对定间距电沉积微镍柱表面形貌的影响

电沉积过程中电极极间距的恒定可以有效地提高电沉积的沉积效果,研究了脉冲电压幅值、脉冲占空比和负向脉冲电流对微镍柱表面形貌的影响。为了探索当极间距恒定后脉冲电压幅值、脉冲占空比和负向脉冲电流对微镍柱表面形貌的影响,采用扫描电子显微镜和体式显微镜观测微镍柱表面形貌,采用COMSOL Multiphysic软件对电流密度和电场强度进行仿真验证,研究各个工艺参数对微镍柱表面形貌的影响,对比在相同参数下定间距与变间距沉积、有无负向脉冲电流的微镍柱的表面形貌。结果表明:在定间距下,电压在4.1~4.7V时,可以得到圆柱度较好且平均直径在47~100μm的微镍柱;在电压为4.7V时,微镍柱呈尖锥状,无分叉现象和瘤状沉积,随着电压的增加,沉积速率从0.33μm/s增长到0.7μm/s,优化后的负向脉冲电流参数为电压2V,频率0.5kHz,占空比60%,单个周期内正负脉冲个数比值5:1。恒定极间距可以改善微镍柱呈堆叠状沉积的现象,增加负向脉冲可以对微镍柱实现一定的修整效果,同时起到消溶沉积层的微毛刺、微凸起和枝状晶作用。

电沉积增材制造微镍柱的工艺研究

目的探究电沉积工艺参数对无掩模定域性增材制造微镍柱的微观形貌、直径和沉积速率的影响。方法采用尖锥形铂丝作为阳极、铜板作为阴极,电镀液从阳极和导流腔之间的微缝隙以射流方式流到阴极表面,电化学沉积增材制造微镍柱。采用体视显微镜和扫描电子显微镜对镍柱微观结构进行检测。通过单因素试验研究极间电压和初始极间距对微镍柱微观形貌、沉积速率和直径的影响规律。结果初始极间距为10μm、电压为3.8~4.4V时,可以制备出直径均匀、圆柱度较高的微镍柱;电压增至4.7V时,微镍柱形状不规则,常伴有分叉现象或呈瘤状沉积。极间电压从3.8V增加到4.7V时,微镍柱体积沉积速率由539μm~3/s增长至4159μm~3/s,直径由55μm增长至102μm。此外,当极间电压为4.1 V、初始极间距为20~40μm时,随着初始极间距的增大,微镍柱顶端从圆柱形逐渐转向锥形沉积。结论极间电压对微镍柱微观形貌、沉积速率和直径的影响明显,初始极间距主要影响微镍柱顶端的沉积生长形状。

髓鞘调控因子的镍金属螯合纯化及影响因素研究

为研究髓鞘调控因子(myelin-gene regulatory factor,MYRF)的镍金属螯合层析纯化方法及其影响因素,以导入MYRF基因的BL21大肠埃希菌为宿主菌,设置不同浓度梯度的咪唑和EDTA洗脱进行镍金属螯合层析柱纯化,通过蛋白质浓度测定、考马斯亮蓝染色和SDS-PAGE分析等方法分析差异,进一步研究蛋白质上清液与镍填料结合时间对MYRF蛋白纯化的影响。结果表明:咪唑洗脱获得的蛋白质浓度与洗脱液浓度呈正比,0.2 mol·L^(-1)的咪唑洗脱液可获得纯度较高的MYRF蛋白;而低浓度(0.05 mol·L^(-1))EDTA洗脱液虽可快速获得高浓度MYRF蛋白,但杂蛋白含量也较高;同时,MYRF蛋白浓度与结合时间呈正相关。综上,MYRF蛋白镍金属螯合层析受洗脱液种类、填料结合时间等多种因素影响,研究结果为MYRF蛋白纯化策略的选择和优化提供参考依据。

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌α-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白为研究对象,分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物,Bradford法测定蛋白含量,兔红细胞测定半数溶血效价,结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带,达电泳级纯度。与此同时,凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%,蛋白含量为0.337 mg/mL,溶血活性为1519 HU/mg;镍柱亲和层析的纯化率为17.5%,蛋白含量为0.35 mg/mL,溶血活性为1463 HU/mg。由此可见,凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。

脉冲电压幅值与电解液流动状态对无掩模定域性电沉积微镍柱的影响

为探究脉冲电压幅值与电解液流动状态对无掩模定域性电沉积微镍柱的影响,采用体视显微镜和扫描电子显微镜SEM对电沉积的微镍柱进行观察、检测,并计算了平均沉积直径和速率。在实验的基础上通过控制变量法研究了脉冲电压幅值与电解液流动状态对沉积微镍柱平均直径、平均沉积速率和表面形貌的影响。研究表明,当脉冲电压幅值在3.8~4.4 V时,电压幅值越大,微镍柱沉积速率越大,表面形貌越粗糙;平均沉积直径和速率会随电解液流动状态变化而发生改变,当流量在0.025~0.25 mm^(3)/s时,沉积速率随电解液流量的增加而加快;电压由3.8 V增至4.4 V时,液滴、微液滴和微射流状态下微镍柱沉积直径增大,冲击射流状态下微镍柱直径则先增大后减小且微镍柱顶部呈明显的尖锥状并在镍柱周边存在"毛刺";微镍柱的表面形貌随电解液流动状态的不同而不同,大流量喷射(0.25 mm^(3)/s)条件下,微镍柱表面更平整、致密。

镍铝基柱撑蒙脱石的制备及孔道结构研究

以钠基蒙脱石为原料,采用共聚法合成镍铝柱化剂,利用离子交换法制备镍铝基柱撑蒙脱石。通过研究不同镍铝物质的量比例和不同NaOH的量对柱撑蒙脱石制备的影响,并对其孔道结构进行探讨。XRD结果表明,当镍铝物质的量比为1∶6、加入75mlNaOH时,可得到(001)面网层间距达1.8940nm的镍铝基柱撑蒙脱石。FT-IR显示,镍铝基聚合羟基阳离子进入蒙脱石层间,柱撑蒙脱石的基本结构并未发生改变。对柱撑前后蒙脱石的比表面积和孔径结构进行分析,发现镍铝基柱撑蒙脱石比表面积为169.68m2/g,平均孔径为4.120nm,说明镍铝基柱撑蒙脱石具有较大的比表面积,较小且均匀的孔径分布,是一种合适的催化和吸附材料。

高精度镍微柱阵列模具的制造

使用基于SU-8胶的微电铸工艺制造了一款微柱宽度为200μm,高度为300μm,柱间隙最小为200μm的镍微柱阵列模具。针对制造过程中SU-8光刻胶去胶难的问题,提出了一种预置溶胀间隙的方法。该方法可以使完整的胶膜分割成许多独立单元,独立的胶膜单元在去胶时溶胀破裂,脱离金属微结构。去胶释放后微柱结构表面光洁、无残余光刻胶,微柱阵列的宽度尺寸误差低至1.35%。研究表明:预置溶胀间隙的方法具有易操作、成本低等优点,可以应用于微小结构的去胶。

丁二酸柱撑水滑石的制备及表征

以镍铝水滑石为前体(主体),以蒸馏水为分散介质,用离子交换法组装丁二酸根(客体)插层水滑石,同时用一步合成法合成丁二酸根插层水滑石,并用XRD,IR,TG-DTA和元素分析等手段对样品进行了表征。结果表明,离子交换法制得的产品中丁二酸根阴离子取代了镍铝水滑石前体层间的碳酸根离子,组装得到晶体结构良好的丁二酸根插层水滑石,层间距为1.23 nm。

狂犬病病毒核衣壳蛋白的原核表达与鉴定

为实现狂犬病病毒核衣壳蛋白在原核系统中高效表达,参考GenBank中发布的RV N基因序列(登录号为1489853),在不改变RV N蛋白氨基酸序列的情况下,对该基因的密码子进行优化,化学合成N基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a(+)/RV N,将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用His-tag镍柱进行重组RV N蛋白的纯化,对纯化后的RV N蛋白进行SDS-PAGE鉴定及Western blot分析。结果表明:重组质粒双酶切后在1359 bp处有目的条带,经测序后与其所对应的已知基因序列完全相符,当重组菌在IPTG浓度0.1mmol/L、30℃诱导6 h,RV N蛋白表达量最高;经过镍柱纯化获得了RV N重组蛋白;BCA法测得重组RV N蛋白浓度达1.783 mg/mL;在51KD处可见明显的蛋白印迹,与预期目的条带相符;使用该方法成功在大肠杆菌系统高效表达了RV N蛋白,为后续狂犬病的检测与新型疫苗的研制奠定了基础。

栉孔扇贝Foxl2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与检测

以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L^(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL^(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。

DNA聚合酶β在食管癌组织中的修复功能

目的:观察突变型DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)的碱基切除修复(base excision repair,BER)功能的改变.方法:将polβ真核表达载体pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2以脂质体介导方式转染polβ基因敲除的EC9706细胞,G418筛选得到稳定转染pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2的细胞克隆;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白;退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化的野生型和突变型polβ蛋白进行BER修复实验.结果:G418筛选得到稳定转染pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2的EC9706细胞;提取并纯化出polβ1、polβ2蛋白与退火合成单碱基缺口的DNA底物进行BER实验.在BER实验中,野生型polβ能够在DNA底物的酶切位点处将其完全切开,而突变型polβ仅将其部分切开.结论:野生型的polβ能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型的polβ碱基切除修复功能明显减弱.

蛋白质层析系统在实验教学中的应用

设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-PAGE鉴定分析,最终获得高纯度的GFP蛋白。通过该实验使学生深入、全面、系统地掌握生命科学研究中最新的蛋白质分离纯化技术,提高学生的科研水平和综合能力。

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

目的构建生产辅酶Q10的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tusB10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coliJM83中表达。同时利用H is-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q10。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol.L-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达Rhodobacter capsula-tusB10的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q10。

小鼠IL-33的原核表达、纯化及鉴定

目的:在大肠杆菌中表达具有生物学活性的白细胞介素-33(mIL-33)。方法:用PCR技术扩增小鼠IL-33成熟蛋白的编码区,与原核表达载体pET-44连接,构建pET-44-mIL-33表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,MTT法测定纯化IL-33的生物学活性。结果:成功构建了pET-44-mIL-33原核表达载体,并在大肠杆菌中表达出可溶性mIL-33,SDS-PAGE分析纯化产物纯度为95%,表达产量为95mg/L。细胞增殖实验表明IL-33有抑制P815细胞增殖的活性。结论:获得了有活性的重组IL-33蛋白纯品,为后续功能研究奠定了基础。

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建胱抑素C(cystatin C,Cys-C)原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a(+)-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalac-topyranoside,IPTG)诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank(NM-000099.2)中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20 000,经Ni2+-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。

胃癌组织来源的突变型DNA聚合酶β的碱基切除修复功能

目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。

A型肉毒毒素Hc基因的原核表达、纯化及单抗的制备

在大肠埃希菌中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原,是以包涵体形式存在。溶解后的包涵体溶液经过处理,用镍柱亲和层析法纯化,得到纯度约为90%的融合蛋白。利用纯化的重组抗原BoN-Ta免疫Balb/c小鼠,获得分泌抗BoNTa特异性的3株杂交瘤细胞株2A2、4F7和2A8,其单抗鉴定均为IgG1亚型,滴度达到1∶105。高纯度和活性单抗的获得为毒素检测试剂盒的研究奠定了基础。

CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。