无水体系中环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶制备高载量固定化金属亲和层析介质

在以二甲基亚砜为溶剂的无水体系中,利用环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶Sepharose6FastFlow进行活化,并偶联亚氨基二乙酸和Cu2+制备了固定化金属亲和层析介质.结果表明,该体系中环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高,在40%(φ)环氧氯丙烷、0.02g/mLNaOH及50℃、反应时间4h的优化条件下,环氧基活化密度最高达165μmol/mL,较目前报道的最高值提高50%以上.最终所制介质的Cu2+螯合密度为128.3μmol/mL,对BSA的平衡吸附容量达2.05mmol/L.以0.5mol/L咪唑为洗脱剂,被吸附的BSA洗脱率可达90%以上.

琼脂糖凝胶提取纯化抑肽酶的研究

采用琼脂糖凝胶为载体,共价偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,将其用于亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶。通过实验研究,计算抑肽酶抑制比活单位(BAEE单位/mg胰蛋白酶)为79000,酶活性回收率76.63%。该工艺具有操作简便、收率高、产品质量好、污染低等优点,适于工业化,有一定的工业应用前景。

琼脂糖凝胶偶联DEAE基团反应的影响因素

以交联琼脂糖凝胶为基质 ,制备了 DEAE型离子交换层析介质。考察了反应时间、温度、反应物浓度等反应因素对介质离子交换容量的影响。结果表明 ,在 DEAE- HCl浓度为 3mol/ L,Na OH浓度为 3.5 mol/L ,反应时间 1h,反应温度为 6 0℃的条件下 ,介质的离子交换容量达到最大为 0 .16 8mmol/ L ,与商品 DEAESepharose CL - 6

国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质对Omicron株新型冠状病毒疫苗分离纯化效果的比较

目的探讨国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质对Omicron株新型冠状病毒(SARS-CoV-2)灭活疫苗的分离纯化效果,为促进层析介质的国产替代提供数据支持。方法选取3批SARS-CoV-2 Omicron株灭活病毒浓缩液,分别使用国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质在相同实验条件下进行纯化,收集病毒峰并检测收集组分中的抗原含量、蛋白质含量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞宿主蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量等相关质量参数,并计算比活性和抗原回收率。结果在采用10%柱体积和30 cm/h线性流速对两种填料进行上样纯化之后,所得收集组分的平均抗原回收率分别为55.29%和53.31%,差异无统计学意义(t=1.44,P>0.05),比活性、Vero细胞DNA残留量及Vero细胞宿主蛋白残留量间差异也无统计学意义(t分别为-0.25、1.31和0.66,P均>0.05),仅牛血清白蛋白残留量差异有统计学意义(t=-2.73,P<0.05)。结论采用国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质纯化SARS-CoV-2 Omicron株灭活病毒浓缩液,所得收集组分各项质量参数间除牛血清白蛋白残留量外均无显著差异,因此,在纯化Omicron株SARS-CoV-2灭活疫苗时,可考虑使用该国产层析介质替代进口层析介质。

苯基-琼脂糖疏水层析介质的制备

以交联琼脂糖为基质，采用直接偶联法和活化偶联法制备了苯基琼脂糖疏水层析介质。考察了影响反应的因素，并对操作条件加以优化。

电导法测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效方法的验证

目的以氯化钠溶液为样品和洗脱液,对电导法测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效方法进行验证,确定该方法测定柱效的最优条件。方法设计四因素三水平正交实验对电导法测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效方法进行验证,考察不同样品体积、流速、样品浓度和洗脱液浓度对Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效和对称性的影响。依据正交实验结果确定电导法测定柱效的最优条件并进行验证。结果9次实验测得柱效均>2800 N/m、对称性为1.020~1.160。通过单因素方差分析,样品体积对柱效的影响无统计学意义(P=0.123,P>0.05),对对称性的影响无统计学意义(P=0.735,P>0.05);流速对柱效的影响无统计学意义(P=0.600,P>0.05),对对称性的影响有统计学意义(P=0.032,P<0.05);样品浓度对柱效的影响无统计学意义(P=0.319,P>0.05),对对称性的影响无统计学意义(P=0.824,P>0.05);洗脱液浓度对柱效的影响无统计学意义(P=0.930,P>0.05),对对称性的影响无统计学意义(P=0.596,P>0.05)。通过极差分析,确定测定柱效的最优条件为:样品体积为600 mL、样品浓度为1.0 mol/L、洗脱液浓度为0.2 mol/L、流速为20 cm/h;重复性和耐用性考察中柱效RSD均<5%,对称性RSD均<5%。将丙酮对照实验结果和重复性实验结果进行t检验,柱效和对称性结果均无统计学意义(P均>0.05)。结论电导法可用于测定Sepharose 4FF凝胶层析柱柱效,确定的最优条件重复性、耐用性良好,可准确、真实地评估Sepharose 4FF凝胶层析柱的性能。

蛋白质层析系统在实验教学中的应用

设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-PAGE鉴定分析,最终获得高纯度的GFP蛋白。通过该实验使学生深入、全面、系统地掌握生命科学研究中最新的蛋白质分离纯化技术,提高学生的科研水平和综合能力。

国产琼脂糖简介

1.琼脂糖是凝胶层析,凝胶电泳免疫技术的优良载体。本文阐述以我国的水产资源石花菜、江篱等红藻制品琼脂作原料而制造的琼脂糖,并介绍其质量标准、检查方法与应用效果。2.本琼脂糖应用在层析、分离纯化核酸、e 抗原试验等方面都获得满意的结果。且它的某些主要性能优于英国 BOH 同类产品。3.本琼脂糖进一步做成珠状琼脂糖凝胶也获得成功。制品已在凝胶过滤、亲和层析等技术中应用。

亲和层析和双功能结合剂

一、亲和层析亲和层析是近十年来发展起来的纯化高分子生物物质的新技术。作为生化研究工具占重要地位。随着酶的固相化方法的发展,这一方法日趋完善。目前几乎每个生化实验室都需要采用它。

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌α-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白为研究对象,分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物,Bradford法测定蛋白含量,兔红细胞测定半数溶血效价,结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带,达电泳级纯度。与此同时,凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%,蛋白含量为0.337 mg/mL,溶血活性为1519 HU/mg;镍柱亲和层析的纯化率为17.5%,蛋白含量为0.35 mg/mL,溶血活性为1463 HU/mg。由此可见,凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。

重组人IL-31蛋白纯化方法的比较研究

目的比较两种方法纯化rhIL-31的效果。方法将含pET32a/rhIL-31的重组菌E.coli.BL21(DE3)经IPTG诱导表达,通过超声波破碎,包涵体的提取溶解,分别经G75凝胶层析和镍琼脂糖凝胶FF层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分析。结果镍琼脂糖凝胶FF层析法的杂蛋白去除率高于凝胶层析法,所得蛋白纯度略高。结论比较重组人IL-31蛋白的纯化效果,镍琼脂糖凝胶FF层析的效果比G75凝胶层析的效果好。

桔梗多糖的分离纯化与含量测定

利用离子交换凝胶柱层析法分离纯化桔梗多糖,并对纯化组分进行纯度鉴定和糖含量及蛋白质含量测定。桔梗饮片经热水浸提、乙醇分步沉淀得桔梗粗多糖PPS80,Sevage法脱蛋白后,通过DEAE-Sepharose FF离子交换和Sephadex G-75凝胶柱层析进行纯化鉴定。分别采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝染色法测定纯化后各组分的糖和蛋白质含量。试验结果表明,从桔梗粗多糖PPS80中分离得到2个均一性组分PPS80-I和PPS80-Ⅱ,糖含量分别为90.32%和86.75%,蛋白质含量分别为0.48%和1.96%。该试验首次采用DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析结合Sephadex G-75凝胶柱层析有效分离纯化出桔梗多糖均一性组分,为桔梗多糖的进一步研究提供基础。

黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备及应用

旨在提出1种新的具有高灵敏度、特异性抗黄芪甲苷(AST)单克隆抗体的纯化方法,从而为制备具有类似活性基团的其他天然化合物的亲和层析树脂方法提供参考。用AST与环氧活化琼脂糖6B(EAS6B)偶联制备的免疫亲和柱从小鼠腹水中纯化抗AST的高敏单克隆抗体(mAbs),与用G-葡聚糖凝胶从小鼠腹水中纯化的抗AST单克隆抗体进行比较,通过间接ELISA(酶联免疫吸附测定)和间接竞争ELISA比较2种方法纯化的单克隆抗体,评价亲和培养基的效用。间接ELISA结果显示,用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体的效价略高于用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗体效价;间接竞争ELISA结果显示,用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体的结合抑制50%浓度(IC 50)为0.005μg/mL,用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体的IC 50为0.05μg/mL,用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体比用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体对AST更具有特异性。

人心肌肌钙蛋白I的原核表达与纯化

目的构建人心肌肌钙蛋白I(human cardiac troponin I,hcTnI)原核表达载体并表达、分离纯化重组蛋白。方法RT-PCR从人心肌组织中克隆出hcTnI的cDNA序列构建到原核表达载体pQE30,获得重组表达质粒pQE30-hcTnI,并在大肠杆菌M15中诱导表达。镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,Western Blot杂交鉴定重组蛋白。结果经测序证实,获得的目的基因与(GeneBank M64247)公布的hcTnI基因序列一致。pQE30-hcTnI在大肠杆菌M15中经IPTG诱导后表达出相对分子量约为29 kD的目的蛋白,镍柱纯化后经抗hcTnI单克隆抗体进行Western印记,在相对分子量约29kD处可见特异性着色带。结论体外成功诱导了重组hcTnI蛋白表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的hcTnI蛋白,为进一步获得hcTnI的抗体及建立相应的临床快速检测方法奠定了实验基础。

Ni在桑细胞内的分布及其结合物的分离

利用细胞分级离心和凝胶层析技术对桑细胞内的Ｎｉ分布及其存在形态作了探讨。细胞可溶性组分中含Ｎｉ量最高（叶片Ｆ＿３占５１％－６４％，根系Ｆ＿３占７４％－８４％），而各种细胞器组分中仅占０．４％－３．４％。细胞可溶性组分中存在的Ｎｉ，大部分与低分子量的蛋白质或多肽类物质一起溶出，因此推测，这种结合有可能是减轻植物金属元素毒害的途径之一。

几种不同分离polyA—RNA方法的比较

本实验采用四种方法:(1)冷酚法。(2)琼脂糖凝胶2 B柱层析(3)超速离心。(4)镁离子沉淀,从大鼠肝中分离出poly A RNA。用(1)法提取总RNA,用其他方法分别抽提pRNA,再分别经Oligo(dT)—纤维素柱层析分离出poly A RNA。从A260/A280,A280/A260,A260/A230,比值、收得率、电泳行为作一比较,初步认为:冷酚法所得polg A RNA收得率较好,但有其他RNA;2 B拄层析法收得率最高,可是纯度较差;超离心法仪器昂贵,不宜普及,镁离子沉淀法则是一个操作简便而又适用的方法。

酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性鉴定

目的 :从牛脑中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)并鉴定生物活性。方法 :根据DenisGOSPODAROW ICZ的方法 ,新鲜牛脑匀浆 ,三步硫酸铵盐析 ,最后沉淀物溶解透析后予离子交换层析及琼脂糖凝胶亲和层析。促 3T3细胞DNA合成率鉴定生物活性。结果 :用 1.0mol/LNaCl的缓冲液洗脱得到分子量为 136 0 0的多肽 ,得率为 6 10 μg/kg牛脑。氨基酸组成分析与已知的aFGF相同。促 3T3细胞DNA合成的最低浓度为 0 .5ng/ml,最大效应浓度 5 0ng/ml,ED50 值为 8ng/ml。结论

大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白，以不同剂量皮下注射免疫小鼠，采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度，并对其他条件进行优化，最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法，利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。

蛋白A的固定及在抗体亲和纯化中的应用

目的以蛋白A作配基偶联活化的Sepharose 4FF后纯化兔免疫蛋白IgG。方法以环氧氯丙烷(ECH)活化凝胶,正交试验确定最佳活化条件;以纯化数据确定抗体兔免疫蛋白IgG纯化最佳缓冲液盐浓度。结果 Sepharose 4FF最佳活化条件:ECH浓度20%(v/v),0.8 mol/L NaOH添加量为1 mL/1 g Sepharose 4FF湿胶,活化时间2.5 h,反应温度40°C。结论建立将活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF与蛋白A偶联的条件,可应用于纯化兔免疫蛋白IgG。