镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库的构建和分析

【目的】寻找镰形扇头蜱吸血后较吸血前唾液腺差异表达基因。【方法】以抑制消减杂交法分别构建镰形扇头蜱半饱血雌蜱和吸血雄蜱唾液腺以pGEM-T-easy为载体的cDNA文库,并测序进行生物信息学分析。【结果】分别测得247个雌蜱有效EST序列和168个雄蜱有效EST序列,并预测雌蜱可能含有5′末端和3′末端的EST序列分别为25个和44个,雄蜱可能含有5′末端和3′末端EST序列分别为53个和74个。随机选择非重复的24个雌蜱序列和21个雄蜱序列以RT-PCR方法验证消减效果;在吸血后唾液腺中,雌蜱有13个基因表达上调或新表达,消减效率为54%,雄蜱有9个基因表达上调或新表达,消减效率为43%。对所测有效序列经BLAST分析,检索247个雌蜱序列获得141个匹配,匹配率为57%,其中有32个蜱基因,占141个匹配基因的23%;检索168个雄蜱序列获得125个匹配,匹配率为74%,其中有29个蜱基因,占125个匹配基因的23%。BLAST检索结果显示这些蛋白主要包括帮助蜱口器固定免疫调节蛋白、抗凝血蛋白、加强能量代谢的线粒体蛋白和促进基因转录的各种转录因子。【结论】这些蛋白主要是为了适应蜱吸血的生理过程及应变蜱因吸血而产生的免疫防御和排斥。

镰形扇头蜱唾液腺cDNA文库的构建

构建了镰形扇头蜱唾液腺 c DNA表达文库。用 Trizol试剂提取镰形扇头蜱唾液腺总 RNA,经反转录合成 c DNA第 1链 ,应用 L D- PCR扩增方法 ,合成双链 c DNA。用 Sfi 内切酶修饰此双链 c DNA,使形成两端分别带有 Sfi A和Sfi B的粘末端。经 CHROMA SPIN- 4 0 0柱纯化 ,收集 4 0 0 bp以上的双链 c DNA片段 ,将其连接于带有 Sfi A和 Sfi B末端的λ Tripl Ex2噬菌体载体 ,经体外包装后 ,以 XL1 - Blue为受体菌构建 c DNA表达文库。经测定 ,库容量为7.0 8× 1 0 5,重组率为 95 .2 %。扩增后的文库滴度为 1 .4 5× 1 0 9pfu/ m L。随机挑取 2 0个克隆转化到质粒 p Tripl Ex2 ,经抽质粒、测序得到

湖北省水牛巴贝斯虫病调查研究 Ⅴ.镰形扇头蜱经卵传递牛巴贝斯虫的证实

1986年从病牛身上摘下饱血雌蜱,经实验室饲养,孵化为第二代成蜱,人工越冬。于1987年将上述蜱100只接种于已去脾23天的一岁龄健康水牛,以后每天从该牛身上取蜱查其唾液腺。结果在吸血期间,始终查到梨形虫体,其平均大小为1.3×0.68微米。接种后第4天,牛血中开始出现巴贝斯虫,至第19天,红细胞感染率高达9.6％,单梨形虫体大小为0.84～2.64×0.42～1.22微米,双梨形虫体大小为0.64～1.64×0.37～0.97微米,以后逐渐下阵。该牛出现体温升高)41.6℃)、严重贫血(血红蛋白量2克,红细胞压积14％,红细胞总数177万/毫米~3)、黄疸及精神萎顿等症状。上述结果表明,该牛感染了巴贝斯虫病,由此证实镰形扇头蜱是经卵传递巴贝斯虫,其感染阶段是成蜱。

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅱ基因的克隆及其分布

本试验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST中筛选了1个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白（GI：14041807）的同源性为84.47%,肌动蛋白结合位点位于147～167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白基因。以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白的基因组序列,序列分析表明该序列不含内含子。RT-PCR分析表明该基因在镰形扇头蜱的卵及其幼蜱、若蜱、成蜱的壳、唾液腺和肠均有表达。

镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA文库的构建

目的 为了筛选抗蜱及蜱传疾病基因工程疫苗的抗原候选分子,构建了镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA表达文库。方法 用Frizol试剂提取镰形扇头蜱半饱血雌蜱总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用长链PCR(LD-PCR)扩增方法,合成双链cDNA。双链cDNA(ds cDNA)在Sfi I内切酶的作用下,形成两端分别带有Sfi I A和Sfi I B的粘性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集500bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有Sfi工A和Sfl I B末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA噬菌体表达文库。结果 经测定,库容量为4.2×106,重组率为96％。扩增后的文库滴度为2.04×1010pfu/ml。通过对文库中随机挑选的15个克隆进行序列分析,获得一个编码线粒体ATP酶第6亚基蛋白的全长cDNA序列。结论 结果显示,镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA表达文库已构建成功。

镰形扇头蜱中2个新基因的分离、克隆与序列分析

为了对镰形扇头蜱中的生物活性分子进行相关研究，从中得到有价值的抗蜱候选分子，本试验从已构建的镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库中，随机克隆得到100个EST（expressed sequence tag）序列。其中8号和2号序列带有完整的polyA尾，根据此2序列设计引物，经5′RACE（rapid amplification of cDNA ends）得到2序列的全长基因，分别命名为RhHp1和RhHp2，RhHp1基因全长1823bp，ORF（开放阅读框）为1521bp，编码区从110～1631bp，编码506个氨基酸。RhHp2基因全长1002bp，ORF为848bp，编码区从31～879bp，编码282个氨基酸。经蛋白序列分析，RhHp1基因预期编码的蛋白与GenBank中所登陆的序列同源性均小于20％，RhHp2与其他序列同源性最高可达50．81％。经RT（reverse transcription）-PCR分析，与其他各发育阶段相比，RhHp1基因在镰形扇头蜱卵中表达量较低；RhHp2基因在镰形扇头蜱若蜱中低度表达，在其他各发育阶段表达量较高。结果表明，RhHp1和RhHp2基因为镰形扇头蜱唾液腺中分离出来的2个新基因，其表达量随着蜱的发育阶段而发生改变。此2个新基因所编码蛋白的结构和具体的分子生物学功能有待深入研究。

福建省镰形扇头蜱的生物学特性

镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides haemaphysaloides)在福建省家畜体表出现于3月中旬至7月中旬,以4月下旬和5月上、中旬为寄生高峰期。经人工饲养观察。该蜱属于三宿主蜱,每年发生1代。雌蜱吸血期6-14 d,产卵期14-27 d,卵期25-43 d。幼蜱吸血期2-5 d,若蜱吸血期2-4 d,自雌蜱吸血至下一代成蜱出现共需72-127 d.雌蜱一生共产卵1252-5970粒,以未吸血成蜱越冬.未吸血的幼蜱和若蜱分别能存活2-3个月和3-4个月.

镰形扇头蜱金属蛋白酶基因全长的克隆和序列分析

本研究从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST序列中筛选了一个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。cDNA全长1 566 bp,编码区为23 bp～1 456 bp,编码478个氨基酸残基,该蛋白的预测分子量约为55 Ku,等电点为8.87。RT-PCR分析表明,该基因在镰形扇头蜱未吸血成蜱、半饱血成蜱以及唾液腺、肠中表达。

应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验

从非流行区购进无蜱寄生的健康黄牛５头与水牛犊１头，其中３头成年黄牛（２～８岁）在畜舍内用从流行区水牛身上采得的镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ成虫，置于牛耳壳内叮咬；１头运至流行区放牧，让蜱上身叮咬；１头黄牛犊（１０年龄）去蜱后２周，用液氮保存的患病水牛染虫血４ｍｌ（４×１０ ８个虫体）皮下注射；另一头去蜱水牛犊亦同时注射相同剂量的染虫血，作为对照。５头黄牛在试验期间其体温、精神、食欲正常，未出现任何临床症状，感染后１０～１２ｄ外周血液中出现少量不典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率在０．１％以下，持续３～５６消失；对照牛则体温升高（３９．８～４１．１℃），出现贫血、黄疸等症状，红细胞压积（ＰＣＶ）降至２６％，外周血液中出现典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率（ＰＰＥ）高达１２％。对采用蜱叮咬及注射来自病水牛的染虫血为何不能使黄牛感染发病，文中进行了讨论。

镰形扇头蜱组胺结合蛋白全长基因的克隆与分析

从本实验室构建的镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)抑制消减杂交cDNA文库中选择了1条可能编码组胺结合蛋白(HBP)的EST序列(RhHBP),以5′末端快速扩增的方法(5′RACE)扩增获得5′末端序列,拼接获得全长基因。DNAMAN(v4.0)、DNAstar(v4.0)和Genetyx(v4.0)软件分析阅读框、编码产物、序列同源性和系统进化,同时也分析了该基因在吸血前后雌雄蜱体内的表达情况。5′RACE法获得1条约400 bp的DNA片段,克隆测序,拼接获得1条长803 bp的全长基因,编码219个氨基酸残基。该基因在吸血雌蜱唾液腺内特异表达,初步分析该基因是组胺结合蛋白基因。

福建省镰形扇头蜱的扫描电镜观察

扫描电镜观察表明,雌蜱的孔区长宽约0.91mm×0.75mm,孔区有74—78个小孔;气门板呈逗点状,气门斑位于气门板前端正中,呈椭圆形,其周围有很多大小不等的杯状体.哈氏器呈宽卵圆形,前窝感毛6根,孔毛1根,囊孔呈不规则分裂状,远端毛2根平列,中毛4根;若蜱的口下板齿式2/2,每纵列7—8枚齿.气门板椭圆形,有300余个杯状体;哈氏器远端毛2根斜列.幼蜱的口下板齿式2/2,每纵列有6—7枚齿;哈氏器前窝毛5根,远端毛2根斜列,中毛2根;盾板有肩毛、背缘毛、背中毛各I对,异盾有背中毛2对,背缘毛7对。

镰形扇头蜱重组肌钙蛋白Ⅰ抗蜱免疫保护效果的初步分析

为了评估镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ(TroponinⅠ,TnI)作为候选疫苗分子的潜力,应用肌钙蛋白Ⅰ重组蛋白进行了抗蜱免疫实验。将重组蛋白按常规方法免疫新西兰兔,三次免疫后分别用若蜱、成蜱进行攻虫实验,观察其免疫保护效果。结果发现蜱的吸血行为受到一定的影响,与对照相比,若蜱和成蜱吸附率、饱血率、饱血体重和死亡率有显著差异,而在饱血时间上差异不显著,说明TnI基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。

湖北省水牛巴贝斯虫病调查研究(Ⅵ)——镰形扇头蜱体内牛巴贝斯虫虫样体的观察

人工感染牛巴贝斯虫的去脾脏水牛犊2头,当血液中出现巴贝斯虫体,染虫率达0.2%时,于一耳内放入饥饿成蜱,使之吸血。雌蜱吸饱血离休后,收集并分别放在28℃相27℃的恒温箱中,每隔24小时取蜱剪肢,涂片检查。发现置28℃的蜱在72小时,其血淋巴中出现虫样体,96—120小时,虫样体出现最多,144小时仍可见到。成熟的虫样体大小为12.0—15.0×1.8—3.5μm;置37℃的蜱其血淋巴中始终未能查到虫样体。

镰形扇头蜱—新基因的分离、克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

目的分离、克隆镰形扇头蜱一新基因。方法本实验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的100个EST(ExpressedSequenceTag)序列中选取一个带有polyA尾的序列,经5’RACE(RapidAmplificationofcDNA Ends)得到此序列的全长基因,命名为RhHp2,基因全长1002bp,开放阅读框(ORF)从31bp至879bp,共848bp,编码282个氨基酸。经序列比较,RhHp2基因与其它序列在核苷酸水平上基本无同源性,但在氨基酸水平上与其它物种同源性最高可达50.81%。RhHp2基因连接于PET32a(+)载体后克隆于表达菌BL21,1mMIPTG诱导表达,产生分子量约为55kD的融合重组蛋白,并以不溶性包涵体形式存在。经纯化和体外复性的重组蛋白三次免疫新西兰兔后,将镰形扇头蜱未吸血成蜱和若蜱接种于此免疫兔耳,并对接种48h后的蜱上体数、蜱的饱血数量、饱血时间、饱血重量等进行记录。结果发现蜱的吸血行为受到一定影响,若蜱在48h的减虫率(上体数减少)为58%,在整个吸血过程中的死亡数增加,成蜱的饱血体重显著降低。结论此结果表明RhHp2基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ(TnI)的cDNA并进行表达及鉴定。方法用RT-PCR方法从镰形扇头蜱总RNA中克隆编码肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段,将该cDNA连接到pET-32a(+)表达载体,并转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western blot分析。结果获得镰形扇头蜱的eDNA,并在大肠杆菌中以包含体的形式高效表达,Westem blot分析表明,抗TnI重组蛋白兔血清可以识别蜱体内的TnI,并在22 kDa和36 kDa之间有两条带。结论蜱体内可能同时存在两个大小不等的TnI,为进一步的研究打下基础。

镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP基因的克隆和重组表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究,本试验根据GenBank中的镰形扇头蜱组胺结合蛋白(Rhipicephalus haemaphysaloideshistamine bindingprotein,RhHBP)基因cDNA序列,设计一对特异性引物(内含EcoRI/XhoI酶切位点),经RT-PCR扩增了镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP的cD-NA,大小为603 bp,将其克隆到pGEM-Teasy中并测序。在去除编码RhHBP信号肽的核苷酸序列后,将其亚克隆到pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1-RhHBP,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为1 mmol/L IPTG诱导其表达,表达的融合蛋白大小为49 ku,以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫原性。

镰形扇头蜱的生物学特性及检疫

介绍镰形扇头蜱的分布、危害、生物学特性等,以指导口岸检疫,防止该蜱及蜱传疾病的入侵和扩散。

镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析

蜱是动物常见的外寄生虫 ,并且传播多种人和动物的疾病 ,严重危害畜牧业发展和人类健康。为了寻找基因工程疫苗候选抗原基因 ,根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子偏好设计引物 ,PCR扩增、测序并分析得到 2个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片段cysA和cysB ,再通过RACE的方法得到全长基因序列。cysA全长 1168bp ,编码 3 3 2个氨基酸 ;cysB全长 1153bp ,编码 3 3 5个氨基酸。经过分析 ,CysA和CysB均与其他蜱种或物种的组织蛋白酶L 样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性 ,两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列 ,因此cysA ,cysB均为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L 样半胱氨酸蛋白酶基因。RT PCR分析表明 。

镰形扇头蜱IgG结合蛋白基因的克隆与表达分析

本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出一个IgG(IgG binding protein,IGBP)基因的全长序列,该基因全长683bp,编码178个氨基酸,预测分子量为19.5kDa,经同源性比较该基因与具尾扇头蜱的IGBP-MB基因序列的同源性高达92%。用RT-PCR方法分析了该基因表达的性别特异性、各个器官、不同发育阶段的表达情况,结果表明,该基因表达没有性别特异性;IGBP基因在唾液腺、壳这2个器官有所表达,但在肠中却没有表达;在蜱的各个发育阶段均有表达。