长双歧杆菌BB68S对便秘人群的通便和调节肠道菌群作用

功能性便秘是影响人类健康最普遍的疾病,通过调节饮食结构加以缓解是治疗便秘的主要方法。本研究的目的是评价长双歧杆菌BB68S的润肠通便作用和对便秘人群肠道菌群的影响。通过招募便秘人群试食BB68S样品(添加有BB68S的牛奶,活菌浓度约为10^10CFU/50mL)4周后发现,试食后与试食前相比,排便次数显著增加;最后一次排便状况积分及粪便性状积分显著降低;粪便中乙酸、丙酸、丁酸、总酸含量显著上升;益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量显著增加(P<0.05),潜在致病菌肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌的数量显著下降(P<0.05)。结果表明,BB68S样品具有良好的润肠通便功能,并能调节肠道菌群。本试验为开发含有BB68S相关功能食品提供了理论依据。

长双歧杆菌BB68S体内及体外安全性评价

本研究对长双歧杆菌BB68S进行了体内及体外安全性评价,为菌株的工业化应用提供基础保障。通过体外试验评价了BB68S的抗生素敏感性和生物胺的生成;体内试验评价了BB68S的经口毒性及移位风险。结果表明,菌株BB68S不存在菌株特有的抗生素敏感性,排除了抗生素抗性横向转移的风险;经过在脱羧酶培养基中培养未发现该菌株产生生物胺;灌胃试验和急性经口毒性试验发现,将该菌株分别以108cfu/鼠、109cfu/鼠、1010cfu/鼠剂量饲喂小鼠28d后,小鼠未发生不良反应,在其血液、肾脏、肝脏未发现该菌株。研究未发现菌株BB68S的不安全因素。

长双歧杆菌BBMN68治疗婴儿CMPA腹泻的效果及对EOS、IgE及白介素水平的影响

目的探讨长双歧杆菌BBMN68治疗婴儿牛奶蛋白过敏(CMPA)性腹泻的效果及对患儿嗜酸性粒细胞(EOS)、血清免疫球蛋白E(IgE)、白细胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-1β的影响。方法选取我院儿科收治的90例CMPA腹泻婴儿(收集时间:2015年6月—2016年6月),对照组45例患儿均停止原喂养方式,改用深度水解蛋白配方奶粉喂养方式、进行对症处理,研究组45例患儿同时给予长双歧杆菌BBMN68治疗,对比两组患儿治疗2周后的外周血EOS,血清IL-4、IL-6、IL-1β、IgE水平及临床效果。结果治疗前,研究组和对照组的外周血EOS,血清IL-4、IL-6、IL-1β、IgE水平比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,研究组的外周血EOS,血清IL-4、IL-6、IL-1β、IgE水平均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后,两组患儿的外周血EOS,血清IL-4、IL-6、IL-1β、IgE水平较本组治疗前均显著降低(P<0.05);治疗后,研究组疗效显著优于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论长双歧杆菌BBMN68治疗婴儿CMPA性腹泻效果肯定,同时显著的降低患儿血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE水平及外周血EOS水平。

长双歧杆菌BBMN68微胶囊的制备及其应用性评价

长双歧杆菌BBMN68分离自广西巴马长寿老人粪便,已证明其具有双歧杆菌普遍的生理功能。为解决其不耐酸、不耐氧的缺点,本实验采用微胶囊包埋技术,以海藻酸钠、乳清蛋白以及VE为壁材,在氮气体系中采用挤压法包埋该双歧杆菌活菌体制备湿微胶囊和冻干微胶囊。结果表明:海藻酸钠、乳清蛋白和VE质量分数分别为2%、3%和10%条件下制备的湿微胶囊在酸奶中保存21 d仍能保持106 CFU/g以上的活菌数,耐胃酸实验2.0 h时活菌数仍高达3.16×107 CFU/g,肠溶实验中微胶囊在2.0 h实现完全崩解;海藻酸钠和乳清蛋白质量分数为2%和3%,氮气环境下制备的冻干微胶囊通过恒温加速实验测定可在室温条件下贮藏长达75 d。通过微胶囊包埋技术较好地解决了长双歧杆菌BBMN68不耐酸、不耐氧的缺点,同时也提供一种新型有效的补充肠道益生菌的形式。

长双歧杆菌BBMN68冷冻保护剂筛选与优化

为提高长双歧杆菌BBMN68的冷冻保藏效果,以冷冻存活率和菌株活力为评价指标,分别评价了4个类型的18种冷冻保护剂。结果表明,脱脂乳、海藻糖、果糖、甘油、维生素C、L-Glu能对BBMN68有效保护。采用二次回归正交设计,对筛选得到的6种保护剂进行复配,得到复配保护剂的最优配方（质量分数）为：甘油3%、海藻糖5%、果糖5%、脱脂乳8%、维生素C 0.05%、L-Glu 0.05%。在复配保护剂的作用下,-80℃保藏期间BBMN68菌数稳定,活菌对数值始终保持在10.51g（cfu/mL）;冷冻浓缩物作为直投发酵剂应用于酸奶中,在21 d内菌数变化不大,始终保持在10~7 cfu/mL以上。

长双歧杆菌BBMN68工业化培养基筛选

本实验以长双歧杆菌BBMN68生长状况为评价指标筛选一种低成本、易配制的工业化培养基。实验比较了菌株在四种常用双歧杆菌培养基中的生长状况,结果表明NPNL培养基生长效果最好(P<0.05);通过低成本氮源代替NPNL氮源,发现玉米浆干粉培养效果最好(P<0.05),玉米浆干粉最佳用量为55g/L;玉米浆干粉培养基中剔除磷酸盐缓冲液、无机盐溶液、L-半胱氨酸盐酸盐,对BBMN68生长状况没有显著性影响(P>0.05)。长双歧杆菌BBMN68工业化最佳培养基配方为:55g/L玉米浆干粉,10g/L葡萄糖,1g/L吐温-80,活菌数达到4.4×109cfu/mL。

长双歧杆菌BBMN68在胃肠道中生物分布规律研究

为进一步研究长双歧杆菌BBMN68作为益生菌服用后在胃肠道中的存保留与排空情况,借助叠氮溴化丙啶-实时定量PCR(PMA-qPCR)技术开展试验。对6~8周龄的SD雌性大鼠进行BBMN68菌株分组灌胃,一次灌胃组按照一定剂量(1.0×10^(10)CFU/kg体重)灌胃一次,灌胃结束后分别测定大鼠体内胃、小肠、结肠、直肠4个胃肠道部位内容物中的菌体浓度;连续灌胃组按照上述剂量连续灌胃7天;灌月服结束后收集粪便,检测粪便中的菌体情况。结果表明,长双歧杆菌BBMN68在胃和小肠中存活率均较低,在结肠和直肠中存活率较高,并可在结肠中进行增殖。在连续灌胃7天菌种后,菌种历时3天排空。由此可知,如果想要长双歧杆菌BBMN68在肠道中维持较好状态,需每日坚持服用BBMN68益生菌。

长双歧杆菌BB536在孕产妇乳粉中的稳定性研究

探讨了向孕产妇乳粉内添加益生菌长双歧杆菌BB536,通过控制乳粉的水分含量和水分活度,采用不同温度的加速实验,研究BB536在乳粉内的稳定性。结果显示,长双歧杆菌BB536添加到孕产妇乳粉中,控制孕产妇乳粉的水分活度为0.14左右,水分含量为2.5%左右,放置温度25℃、30℃、37℃和42℃,放置时间60d,不同时间点检测的活菌数并无明显的下降趋势,BB536的存活率都能达到99%以上,说明BB536非常适合于益生菌孕产妇乳粉的开发。

氧气胁迫对长双歧杆菌葡萄糖代谢关键酶基因表达的影响

双歧杆菌对氧气敏感,耐氧性成为其重要的性状及研究内容之一。实验采用半定量RT-PCR法对在4%氧气条件下培养的长双歧杆菌BBMN68的葡萄糖代谢中关键酶基因mRNA表达水平进行了比较和分析。结果表明,随着氧气浓度增加,长双歧杆菌BBMN68的生长逐渐受到抑制,在4%浓度胁迫条件下,葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、磷酸酮醇酶、转酮醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶在氧胁迫30min时的mRNA表达明显下降,60min及120min后,xfp和gap酶的mRNA表达量恢复到厌氧条件下的水平。研究了长双歧杆菌在氧气胁迫下菌体生长以及葡萄糖代谢中关键酶基因mRNA的变化情况,这些可能是细胞受到氧气胁迫的应激反应之一,推测葡萄糖代谢酶与长双歧杆菌耐氧性有一定关联。

长双歧杆菌NCC2705群体感应系统信号分子AI-2的检测

目的:用生物学方法检测长双歧杆菌NCC2705是否产生群体感应系统信号分子AI-2。方法:将长双歧杆菌NCC2705不同时间点的培养上清分别加至AI-2特异报告系统哈氏弧菌BB170中,以空白培养基上清为对照,用荧光光度计对哈氏弧菌发光强度进行计量,推测出长双歧杆菌NCC2705上清中是否含有分泌的AI-2,并由此推断AI-2的活性。结果:通过微孔板检测系统对加入长双歧杆菌NCC2705培养上清的哈氏弧菌BB170进行检测,发现双歧杆菌上清的加入增强了哈氏弧菌BB170发出的荧光强度。结论:长双歧杆菌NCC2705中存在依赖于luxS/AI-2的群体感应系统,并能够分泌有活性的AI-2,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705AI-2及luxS基因的功能打下基础。

长双歧杆菌BBMN68诱导的树突状细胞对小鼠牛乳β-乳球蛋白过敏的缓解作用

为研究益生菌缓解食物过敏的作用机制,本实验以牛乳β-乳球蛋白(BLG)为过敏原构建小鼠食物过敏模型,灌服长双歧杆菌BBMN68(BBMN68),采用ELISA方法检测小鼠血清及细胞培养上清中抗体和细胞因子含量,流式细胞术分析小鼠体内树突状细胞(DCs)亚型及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量的变化。结果表明,BBMN68调节了BLG小鼠体内的Th1/Th2细胞失衡,缓解了过敏反应。与过敏组小鼠相比,BBMN68显著提高了派氏淋巴结DCs中CD103表达(p<0.05),并降低了CD86和MHC-II表达(p<0.05);提高了派氏淋巴结,肠系膜淋巴结和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量,分别增加41.91%、71.16%和61.25%。分离BBMN68组小鼠派氏淋巴结的DCs与BLG过敏小鼠的CD4+T细胞共培养,发现Foxp3+Treg细胞比例显著增加,调节性细胞因子TGF-β和IL-10分泌显著增多(p<0.05)。以上结果说明BBMN68缓解小鼠牛乳β-乳球蛋白过敏的机制与其调节DCs功能,促进其介导的免疫抑制有关。

长双歧杆菌BBMN68可溶性蛋白质图谱的建立

为了建立长双歧杆菌BBMN68蛋白质图谱,采用双向电泳的方法建立了2-D参考图谱,通过MALDI-TOF/MS质谱鉴定和数据库搜索,鉴定到206个蛋白质(占长双歧杆菌BBMN68基因预测总蛋白的11.4%)。通过2-D胶分析,共有800±15(对数期)和800±20(稳定期)个蛋白质,其中282个蛋白点成功鉴定,代表206个不同的蛋白质。另外,分析了实验鉴定蛋白质的等电点和分子量,蛋白功能,密码子偏好性,蛋白质疏水性以及蛋白质细胞定位的分析。研究结果为长双歧杆菌的比较蛋白质组学研究提供了参考图谱和蛋白质基础信息数据。

信号分子AI-2对长双歧杆菌BBMN68耐受胁迫能力的影响

双歧杆菌是一种广泛应用的益生菌,但是受到环境胁迫后,菌株活力大幅降低,影响菌株功能发挥,其中信号分子AI-2在益生菌耐受环境胁迫中发挥关键作用。文章研究了外源添加AI-2对双歧杆菌BBMN68耐受酸、胆盐及氧胁迫能力的影响。结果表明,外源添加AI-2可以显著提高BBMN68在p H4.0酸胁迫的存活率(P<0.05),显著降低氧气的抑制作用(P<0.05),对在0.1%浓度胆盐下的生长无显著影响(P>0.05)。该研究表明,可以通过外源干预来提高长双歧杆菌的环境耐受能力。

双歧杆菌二联制剂对小鼠抗氧化水平及肠道菌群的影响

目的:旨在探究长双歧杆菌BB536联合乳双歧杆菌HN019益生菌制剂对小鼠抗氧化水平及肠道菌群的影响,为益生菌制剂的开发利用提供依据。方法:将48只小鼠随机分为空白(Control)和低(L)、中(M)和高剂量(H)组,分别灌胃生理盐水和不同剂量的双歧杆菌二联制剂,连续30 d。给药的第0、30天,采集小鼠粪便样品进行细菌计数,30 d采集小鼠粪便进行16S rDNA高通量测序以及短链脂肪酸测定,并测定小肠、肝脏组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平。结果:与Control组相比,双歧杆菌二联制剂灌胃对小鼠的摄食、体重和脏器系数等无显著影响。小肠组织中H组T-SOD活力、GSH水平极显著升高(P<0.01);M、H组均能极显著升高GSH-Px水平(P<0.01),极显著降低MDA水平(P<0.01)。肝脏组织中,与Control组相比,M组GSH、GSH-Px显著升高(P<0.05),在H组中极显著提高(P<0.01)。在肝脏中,M、H组与Control相比,T-SOD活力极显著提高(P<0.01),MDA水平极显著下降(P<0.01)。灌胃30 d后,与Control组相比,各剂量组肠杆菌和肠球菌含量无显著差异,M组的乳杆菌和双歧杆菌含量显著增加(P<0.05),H组的乳杆菌和双歧杆菌含量极显著增加(P<0.01)。16S rDNA高通量测序结果表明,与Control组相比,L组Lachnospiraceae_NK4A136.group和Odoribacter丰度显著升高(P<0.05),M组罗氏菌属丰度显著升高(P<0.05),Mucispirillum和Oscillibacter丰度显著降低(P<0.05);H组中粪杆菌属丰度显著增加(P<0.05),双歧杆菌属丰度极显著增加(P<0.01)。灌胃双歧杆菌二联制剂可有效提高乙酸(P<0.01)、丙酸(P<0.01)和丁酸(P<0.05)含量。结论:综上,益生菌长双歧杆菌BB536联合乳双歧杆菌HN019益生菌制剂能够有效增加GSH水平及T-SOD、GSH-PX活力,降低MDA水平,抑制Mucispirillum和颤杆菌属有害菌的增殖,促进有益菌Lachnospirace_Nk4A136_group、Odoribacter、罗氏菌属、双歧杆菌属和粪杆菌属的生长,提高乙酸、丙酸和丁酸3种短链脂肪酸含量,增强机体抗氧化能力,改善肠道微环境。

益生菌复合制剂对头孢曲松钠作用小鼠的抗氧化指标、细胞因子及肠道菌群的影响

目的:探究长双歧杆菌BB536和乳双歧杆菌HN019组成的益生菌复合制剂对头孢曲松钠引起的肠道菌群失调的改善效果。方法:头孢曲松钠(2 mg/g)连续灌胃小鼠5 d,构建肠道菌群失调模型小鼠,然后随机分为模型组,益生菌复合制剂低剂量组(2×10^(5)CFU/g)、中剂量组(4×10^(5)CFU/g)、高剂量组(1.2×10^(6)CFU/g),另设正常鼠为对照组,第6 d起各剂量组灌胃相应剂量的益生菌复合制剂,对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水,连续灌胃30 d。灌胃结束后无菌收集小鼠粪便对肠道菌群计数,并进行16S rDNA高通量测序分析菌群的多样性以及结构,测定血清中白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)水平,测定空肠和肝脏中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、总超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)水平。结果:给药头孢曲松钠后,血清中IL-2、IL-6、IL-1β和TNF-α水平有上升趋势,空肠中MDA水平显著上升(P<0.05)且T-SOD水平显著下降(P<0.05),在高剂量的益生菌复合制剂的干预下,IL-6和IL-1β水平显著降低(P<0.05),IL-2和TNF-α水平极显著降低(P<0.01),此外空肠和肝脏中的MDA水平均明显下降、T-SOD水平显著提高(P<0.05),GSH-PX水平极显著提高(P<0.01),空肠中GSH水平极显著提高(P<0.01)。在肠道微生物方面,抗生素造损后再灌胃益生菌复合制剂,与灌胃益生菌复合制剂前相比小鼠粪便中肠球菌和肠杆菌数量降低,乳杆菌和双歧杆菌数量提高,微生物多样性分析结果表明各剂量组与模型组相比微生物丰富度有所恢复,且中、高剂量组预测的肠道功能与对照组相比更为接近。结论:益生菌复合制剂可以促进抗氧化物质产生,降低细胞因子水平,促进有益菌的繁殖,提高肠道菌群的丰富度,改善了由头孢曲松钠引起的肠道菌群失调状态。