长双歧杆菌NCC2705菌株应激蛋白的研究

研究长双歧杆菌NCC2705菌株发酵至稳定期时应激蛋白的表达情况。根据乳酸乳球菌IL1403菌株蛋白质参考图谱及长双歧杆菌NCC2705基因组注释中应激蛋白的分子量与等电点,确定应激蛋白在双向电泳凝胶上的相应蛋白点,并利用MALDI-TOF和/或ESI-MS/MS对相应蛋白质点进行鉴定。每个蛋白质点的肽指纹图谱均在长双歧杆菌NCC2705的蛋白质数据库用Mascot进行检索,共鉴定到44个蛋白点对应8个应激蛋白。这些蛋白为亲水性酸性蛋白,大多具有翻译后修饰现象,它们基因的CAI值除DnaJ外,其余均在0.5以上,在全细胞表达谱中为高丰度蛋白;此外,菌体具有较强的抗脂质过氧化和清除DPPH自由基的能力,而对羟自由基和超氧负离子的清除力较弱,推测鉴定到的具有逆转氧化损害作用的碱性过氧化氢还原酶(ahpC)可能是体内表达的降低氧损伤的主要酶。

长双歧杆菌NCC2705高效转化系统的建立及GFP表达

目的:建立长双歧杆菌NCC2705高效稳定的电转化系统,并以其为宿主表达绿色荧光蛋白(GFP),构建一个稳定的带报告基因的表达载体。方法:从双歧杆菌克隆载体pDG7中切取其在双歧杆菌中复制所必需的pMB1复制子插入质粒pUC19的多克隆位点区,并将gfp基因在双歧杆菌中进行表达;设计双歧杆菌电击转化体系,研究在不同电击电压条件下的电转效率。结果:首先构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒pUB1和带有gfp基因的表达质粒pUB2,用电击法将之转化至双歧杆菌,当细菌生长到D600nm约为0.5时制备感受态细胞,在电容25μF、电阻200Ω、电压12.5 kV/cm的电击条件下进行完整质粒转化,可得到较高的转化率。结论:构建了以长双歧杆菌NCC2705为宿主的高效稳定的表达系统,为进一步研究益生菌的分子生物学和功能特性提供了基础。

长双歧杆菌NCC2705群体感应系统信号分子AI-2的检测

目的:用生物学方法检测长双歧杆菌NCC2705是否产生群体感应系统信号分子AI-2。方法:将长双歧杆菌NCC2705不同时间点的培养上清分别加至AI-2特异报告系统哈氏弧菌BB170中,以空白培养基上清为对照,用荧光光度计对哈氏弧菌发光强度进行计量,推测出长双歧杆菌NCC2705上清中是否含有分泌的AI-2,并由此推断AI-2的活性。结果:通过微孔板检测系统对加入长双歧杆菌NCC2705培养上清的哈氏弧菌BB170进行检测,发现双歧杆菌上清的加入增强了哈氏弧菌BB170发出的荧光强度。结论:长双歧杆菌NCC2705中存在依赖于luxS/AI-2的群体感应系统,并能够分泌有活性的AI-2,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705AI-2及luxS基因的功能打下基础。

长双歧杆菌NCC2705纯化蛋白烯醇化酶、Tuf蛋白的黏附作用研究

目的验证功能蛋白烯醇化酶(enolase)和Tuf蛋白是否为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NCC2705的黏附因子。方法将长双歧杆菌NCC2705与Caco-2细胞共培养,显微镜观察加入纯化蛋白烯醇化酶、Tuf蛋白前后细胞黏附细菌数的变化并进行统计学分析。将Caco-2细胞、长双歧杆菌NCC2705、致病菌(弗氏志贺菌或伤寒沙门菌)共培养,检测加入纯化蛋白烯醇化酶、Tuf蛋白前后上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果加入纯化蛋白烯醇化酶、Tuf蛋白之后,Caco-2细胞黏附细菌数显著降低(P<0.05)。Caco-2细胞与致病菌共培养时,LDH和TNF-α的水平显著增高(P<0.05);Caco-2细胞与长双歧杆菌NCC2705和致病菌共培养时,LDH和TNF-α的水平显著降低(P<0.05),然而加入纯化蛋白烯醇化酶和Tuf蛋白后,LDH和TNF-α的水平又出现显著增高(P<0.05)。结论长双歧杆菌NCC2705可竞争性抑制致病菌对肠上皮细胞的黏附,而烯醇化酶和Tuf蛋白可竞争性抑制长双歧杆菌对肠上皮细胞黏附作用,是双歧杆菌的黏附因子。

长双歧杆菌NCC2705 ATP结合蛋白BL0034表达与活性检测

目的克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性。方法以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western印迹验证。结果将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034。BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western印迹结果为阳性。对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP。结论成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提。

长双歧杆菌NCC2705中胆盐水解酶基因的克隆表达及其特性的研究

目的克隆并过表达胆盐水解酶基因,研究胆盐水解酶对菌体胆盐耐受性和胆固醇降解率的影响等特性。方法采用常规原核表达方法在大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NCC2705中过表达胆盐水解酶基因,并进行长双歧杆菌NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705的胆盐耐受性和降胆固醇实验。结果在大肠杆菌中成功表达了NCC2705的胆盐水解酶基因,经纯化的GST空标签和GST融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果显示,胆盐水解酶的相对分子质量约为35×103;构建的过表达bsh的菌株pMgap-bsh/NCC2705比标准菌株NCC2705表现出了略高的胆盐耐受性和胆固醇降解率。结论所构建的高效表达胆盐水解酶菌株可能有利于提高菌体的胆盐耐受性和降胆固醇能力,益生菌的降胆固醇途径不是单一的,培养基中是否含有胆盐对胆固醇的降解率影响较大。