双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

60株临床分离犬小孢子菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性鉴定

目的探索采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行犬小孢子菌的快速鉴定。方法采用真菌通用引物第1内转录间隔区(ITS-1)与第4内转录间隔区(ITS-4)对60株犬小孢子菌进行PCR扩增,然后利用限制性内切酶TaqⅠ和HinfⅠ分别对PCR产物进行酶切分析。结果真菌通用引物ITS-1和ITS-4在60株犬小孢子菌中均扩增出1条长约750 bp的DNA条带;2种内切酶HinfⅠ和TaqⅠ各自显示相同的酶切结果,酶切片段稳定而清晰。结论应用PCR-RFLP方法可以快速、敏感、特异地鉴定犬小孢子菌。

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测肿瘤坏死因子β基因多态性

目的 建立聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)检测肿瘤坏死因β(TNFβ)多态性的方法。方法 采用PCR方法扩增TNFβ第一外显子到第二外显子包含G→A突变在内的DNA片段,扩增产物用限制性内切酶Nco I酶切后电泳,分析TNFβ的基因型。结果 TNFβ检测到3种基因型,分别为TNFβ*1/1、TNFβ*1/2和TNFβ*2/2。结论PCR—RFLP检测肿瘤坏死因子β多态性方法快速、简便、准确、可靠,适合普通实验室开展及大规模研究。

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.

聚合酶链反应限制性片段长度多态性快速检测模拟尿标本中致病念珠菌的研究

目的研究常见的致病性念珠菌的分子生物学鉴定方法,为深部念珠菌的分子诊断奠定基础。方法用白色念珠菌、热带念珠菌、净平滑念珠菌和克柔念珠菌的标准菌株制备模拟尿标本,对其核糖体DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应扩增,对扩增产物进行内切酶MspⅠ的酶切分析。结果4种念珠菌经聚合酶链反应后产生4种不同分子量的条带,扩增产物经酶切后产生4种特异性带型。结论聚合酶链反应—限制性片段长度多态分析方法是一种可靠、稳定、特异的鉴定常见致病念珠菌的方法。

利用聚合酶链反应扩增基因片段

<正> 聚合酶链反应(PCR)是一种模拟天然DNA复制过程的核酸扩增法,具有敏感特异、产率高、操作简单、容易自动化等特点。由于它有成指数倍(2~n)扩增靶序列的能力,又被称之为“无细胞分子克隆”或“试管内分子克隆”。我们以化学合成的寡核苷酸的粗提物为引物,含目的基因片段的重组质粒DNA为模板。

逆转录—聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析对我国肾综合征出血热病毒分型的研究

建立准确、快速、灵敏的汉坦病毒基因分型方法，可弥补传统血清学方法的不足，对防治该病毒所致的肾综合征出血热（HFRS）具有重要意义。本试验采用逆转录－聚合酶反应（RT－PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）和限制性片段长度多态性（RFLP）方法，对流行于我国的两型汉坦病毒代表株－汉滩型（HTNV）76－118 和汉城型（SEOV）R22株进行基因分析。根据病毒DNA序列的电脑软件分析。不同HFRSV囊膜糖蛋白编码基因M节段1199－1497间核苷酸序列上RsaI,TaqI和HindⅢ的酶切位点存在差异（Fig.I),可用于进行限制性内切酶基因多态性分析，以确定HFRV的型别。首先，以一对引物扩增该片段（Fig.2)。然后，分析用这三种内切酶（Fig.3,4,5)进行酶切分型，共分析了从我国不同地区，不同宿主分离的毒株18株，及国际标准毒株2株，酶切图谱显示，这些毒株可以被分为三组（Table.a)：9株可定为HTNV型，8株可定为SEOV型，3株无法确定其型别（X型），该法分型结构与血清学经典的空斑减数中和试验分型结构基本一致，说明该酶切分型方法具有一定的可行性。

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

串珠镰刀菌伏马菌素产毒株聚合酶链反应检测方法的研究

以伏马菌素生物合成所必需的多酮肽合成酶基因fum5为基础 ,设计了 3对特异性引物P1 P2、P3 P4和Fum5F2 1 Fum5 1,建立了串珠镰刀菌伏马菌素产毒株PCR检测方法。以 5株ATCC典型串珠镰刀菌及其他菌株为参考 ,其中ATCC 5 2 5 3 9为伏马菌素B1(FB1)产毒株 ,测定了PCR方法的特异性。ATCC 5 2 5 3 9扩增结果阳性 ,该 3对引物分别扩增出 880bp、70 2bp和 10 40bpDNA片段 ,非伏马菌素产毒株ATCC 3 8946、ATCC2 62 63、ATCC 12 763、ATCC 3 80 16及其他阴性对照菌株 (禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、黄曲霉、拟青霉和大肠杆菌O15 7)结果阴性 ,证明引物具有很好的特异性。同时以不同稀释度的ATCC 5 2 5 3 9DNA为模板 ,测定了 3对引物PCR的敏感性 ,P1 P2每PCR反应的检出限为 10 0pg ,P3 P4和Fum5F2 1 Fum5R1每PCR反应的检出限均为 10pg ,分别相当于每PCR反应检出 10 4和 10 3个孢子。 3对引物PCR检测国内不同地区分离的 3 2株串珠镰刀菌及交孢变种 ,2 6株为伏马菌素产毒株 ,6株为非伏马菌素产毒株。并对部分产毒株PCR(P3 P4)产物 ,应用内切酶EcoRV和BamHI,进行限制片段长度多态性 (RFLP)分析 ,分别产生 181bp、5 2 1bp 2个和 116bp、2 5 8bp、3 2 8bp 3个DNA片段 ,与文献报道值一致 。

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性。方法:在细菌16SrRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBVDNA、3 7份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增。结果:7种对照菌株均获得5 3 0bpDNA片段。而与人基因组DNA、HBVDNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。3 7份腹水中有9份获得5 3bpDNA片段,阳性率2 4 3 % (9/3 7) ,而腹水细菌培养阳性率为5 4%(2 /3 7) ,两者比较差异有显著性意义(P <0 0 5 )。结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16SrRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。

聚合酶链反应直接检测粪便中志贺菌的临床意义

近年来志贺菌在众多的腹泻病致病菌中仍然具有较高的发病率[1].在基层部队常常引起急性细菌性痢疾(急性菌痢),并时呈集体暴发流行.应用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌已早有报道,但应用于临床实际诊断的研究报道不多.本文采用PCR和长臂光敏生物素探针杂交技术对2起急性菌痢,共17例进行了检测,进一步探讨PCR用于临床腹泻病诊断的实用性.

传染病研究动态：外周血和骨髓聚合酶链反应（PCR）在诊断HIV感染者和非HIV感染者内脏利什曼原虫感染的临床应用：意大利一项为期8a的单中心临床研究

为了克服传统微生物检测技术的某些局限性，基于聚合酶链反应（PCR）的方法正被用于诊断内脏利什曼病。作者进行了一项为期8a的单中心对比性研究，即分别采用传统微生物检测技术（如血清血检测、显微镜检测和培养等）和特异性PCR方法检测外周血和骨髓中内脏利什曼原虫。研究对象包括594例免疫功能正常的人（成人和小儿）和与血液学改变／肝脾肿大有关出现发热症状的免疫功能缺陷病人。通过外周血PCR反应直接获得感染原虫的滴度，然后对扩增的样品进行限制性片段长度多态性分析。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

聚合酶链反应检测白喉杆菌的实验研究

目的 建立检测白喉杆菌的聚合酶链反应 (PCR)方法。方法 用PCR扩增白喉杆菌特异的白喉外毒素B基因 (toxB)片段 ,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果 白喉杆菌参考菌株 (有毒株 )均扩增出 318bp的特异性片段 ,而其他需鉴别诊断的常见病原菌均未扩增出此特异条带。检测灵敏度为 85 0fg/ μl基因组DNA。 结论 依据toxB基因建立的白喉杆菌PCR检测方法具有高度的敏感性和特异性 。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

聚合酶链反应检测粪便中志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌

志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌(简称EIEC)是引起夏季腹泻和小儿腹泻的主要病源之一。医院内常规镜检准确性不高;而细菌分离培养鉴定周期长,且受到服用抗生素等因素影响,阳性率低。聚合酶链反应是一种利用DNA扩增技术检测样品中特异性的基因片段,以达到准确、快速目的的新方法。

聚合酶链反应检测腹泻病病原

聚合酶链反应(PCR)是一种高效的DNA体外合成技术,它能将所检测的DNA序列或片段合成数百万倍,据此可以确定含有该特异DNA片段的病原存在。引起腹泻的病原细菌、病毒、寄生虫、霉菌等。其中大多数都已能用该方法检测。以下简要介绍其操作步骤。