小麦-十倍体长穗偃麦草双重异代换系的分子细胞遗传学及抗条锈病鉴定

十倍体长穗偃麦草[Thinopyrum ponticum(Popd.)Barkworth and Dewey]具有抗寒、抗旱、耐盐碱、茎秆粗壮、穗长花多等优异性状,是小麦遗传改良的重要基因资源。本课题组从小麦与十倍体长穗偃麦草的杂交后代中筛选出一份抗条锈病的衍生系CH18067,本研究对其进行形态学、细胞学、原位杂交、分子标记、抗条锈病性等综合鉴定。细胞学观察结果显示,CH18067的体细胞染色体数目为42条,在减数分裂中期Ⅰ的染色体构型为2n=21Ⅱ,在减数分裂后期Ⅰ同源染色体可均等分离,表明其细胞学遗传稳定。利用寡核苷酸探针Oligo-pTa535(红色)和Oligo-pSc119.2(绿色)对CH18067进行FISH鉴定,结果显示,CH18067缺失小麦2D和4D染色体,同时含有2对具有特殊带型的染色体;通过对CH18067进行FISH-GISH、mc-GISH、液相芯片以及染色体核型分析,发现2对具有特殊带型的染色体中,在长臂和短臂末端均呈现Oligo-pTa535探针红色带型的染色体为十倍体长穗偃麦草的2J染色体,在着丝粒位置和长臂末端均呈现Oligo-pTa535探针红色带型的染色体为十倍体长穗偃麦草的4J^(S)染色体,说明CH18067为小麦-十倍体长穗偃麦草2J(2D)+4J^(S)(4D)双重异代换系。在第二部分同源群和第四部分同源群分别筛选出3个特异性标记,可用于追踪小麦遗传背景中长穗偃麦草的2J和4J^(S)染色体。形态学和条锈病抗性鉴定结果显示,CH18067具有矮秆、长粒等特性,且在成株期高抗小麦条锈病。以上结果表明,CH18067可作为小麦条锈病抗性育种和遗传研究的候选种质。

基于SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记

长穗偃麦草1E及7E染色体上带有重要的抗赤霉病基因,开发大量相关染色体特异分子标记有助于准确定位抗性基因及获得可用于辅助育种紧密连锁的标记。基于SLAF-seq技术,获得了368个长穗偃麦草1E染色体特异片段,随机选取80个特异片段设计引物,开发了20个长穗偃麦草1E染色体特异分子标记、2个长穗偃麦草基因组特异分子标记及26个其他特异分子标记,效率达60%。用这些特异标记能稳定检测出不同小麦-长穗偃麦草衍生材料中的1E染色体或片段。通过标记与优良性状的共分离特性,获得与相关基因紧密连锁的标记,将为小麦抗性育种中的分子标记辅助选择提供依据。

中国春背景下长穗偃麦草抗赤霉病相关基因的染色体定位

长穗偃麦草具有良好的赤霉病抗性,是小麦赤霉病抗性改良的重要种质资源。为了深入研究长穗偃麦草的赤霉病抗性并对其抗性相关基因进行染色体定位,连续两年两地于开花期通过单花滴注法对中国春-长穗偃麦草二体附加系、置换系等31份材料进行穗部接种,21d后调查发病情况;同时调查了各材料的自然发病情况。结果表明,长穗偃麦草的赤霉病抗性主效基因定位于1E和7E染色体,其中7E染色体的短臂具有良好的赤霉病抗性,2E和4E染色体具有微效抗性基因,而3E、5E和6E可能存在易感基因。

重金属Cd Zn对长穗偃麦草生理生化特性的影响及其积累能力研究

以长穗偃麦草为材料,采用土培试验方法,研究了重金属Cd、Zn单一及复合污染对长穗偃麦草的生物量、保护酶(SOD和POD)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)的影响,及长穗偃麦草对Cd、Zn的积累能力。结果表明,Cd、Zn单一及复合污染下,长穗偃麦草生物量随Cd和Zn浓度的升高而降低,与对照存在显著差异(P<0.05);Cd和Zn单一污染下,随着Cd、Zn浓度的升高,SOD、POD、MDA、Pro含量增加;Cd和Zn复合污染下,随处理质量浓度的增加,SOD呈下降趋势,POD和MDA呈增加趋势。Cd10Zn200处理下Pro含量减少,随Cd和Zn质量浓度的增加,其他复合处理下的Pro含量增加;植株根部的Cd和Zn积累量均大于地上部的积累量。综合实验结果,可初步判断长穗偃麦草能积累和忍受一定量的Cd、Zn,Cd和Zn复合污染对上述各指标的毒害效应大于同水平单元素污染的效应。长穗偃麦草根茎发达,生物量大,在生长过程中可通过生物量带走部分重金属Cd、Zn,因此长穗偃麦草具有修复重金属Cd和Zn污染土壤的潜能。

长穗偃麦草(Agropyron elongatum,2n=14)与普通小麦间的多态性及E组染色体的特异RAPD标记

以普通小麦中国春、长穗偃麦草及其7个二体异附加系为材料,用26个10碱基随机引物进行随机扩增,以检测普通小麦与长穗偃麦草间的多态性并建立长穗偃麦草染色体特有的RAPD标记。实验结果表明:26个引物在中国春及长穗偃麦中共扩增出180条带,其中中国春121条,长穗偃麦草94条,二者相同的带只有35条,仅占19.44％,另外80.56％的带在二者间揭示了多态性,从分子水平揭示二者基因组间存在着较高水平的多态性。有三个引物OPE—05、OPF—03和OPF—15分别在两亲本间揭示了多态性,同时这一多态性带也分别出现于双二倍体及1E、3E染色体的附加系中,其片段大小分别为1300bp、700bp、400bp,因而OPE—05_(1300)、OPF—03_(700)和OPF—15_(400)分别是1E和3E染色体的特异RAPD标记,可以用来快速地跟踪鉴定1E和3E染色体并应用于偃麦草属的研究中。

利用生化及分子标记确定长穗偃麦草(Elytrigia elongatum, EE. 2n=14)染色体与小麦染色体的部分同源性

利用限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）及等电聚焦（ＩＥＦ）技术确定普通小麦中国春－二倍体长穗僵麦草７个异附加系所附加的外源染色体与小麦染色体的部分同源性，共有８个生化标记，１３个ＲＦＬＰ标记在亲本间揭示了多态性。结果表明：长穗堰麦草的ＩＥ、２Ｅ、３Ｅ、４Ｅ、 ５Ｅ、６Ｅ、７Ｅ ７条染色体分别与小麦染色体的 １、２、３、４、５、６、７ ７个部分同源群具有部分同源关系，堰麦草的ＩＥ与７Ｅ、５Ｅ与７Ｅ染色体间可能发生过重排。同时，研究还分别将Ｅｓｔ－Ｅ５、Ｅｓｔ－Ｅ８位点定位于３ＥＬ，Ｐｅｒ－Ｅ１定位于７Ｅ， Ｐｅｒ－Ｅ４定位于５Ｅ，β－Ａｍｙ－Ｅ１定位于４ＥＬ染色体，并进一步将α－Ａｍｙ－Ｅ１位点定位于６Ｅ染色体长臂上。

普通小麦背景中长穗偃麦草[Lophopyrum elongatum(Host) A. Lve]E染色体组的RGAP特异标记

利用已知植物抗病基因编码氨基酸保守区域NBS-LRR(核苷酸结合位点-富亮氨酸区域)设计了42个简并引物组合,运用抗病基因类似物多态性(resistance gene analog polymorphism,RGAP)分子标记技术,对中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体及其附加系和代换系基因组DNA进行PCR扩增。结果表明,共有38对引物组合获得扩增产物,其中35对在普通小麦中国春、中国春-长穗偃麦草双二倍体中能扩增出多态性,平均每个引物组合扩增出38.5个片段。在普通小麦背景下,共获得275条长穗偃麦草E基因组多态性谱带,占扩增总谱带数的17.44%,揭示出在普通小麦背景下E基因组和普通小麦A、B、D基因组间的高丰度遗传变异。另外,利用RGAP分子标记技术,构建了一套完整的长穗偃麦草1E^7E染色体的特异RGAP标记。为小麦背景中长穗偃麦草外源遗传物质的快速检测提供了新途径。

长穗偃麦草基因组中与耐低磷营养胁迫有关的基因的染色体定位

以中国春－长穗偃麦草二体异附加系和二体异代换系为材料，对其耐低磷营养胁迫特性进行鉴定和遗传分析。结果表明：（1）长穗偃麦草的4E与6E染色体携有耐低磷营养胁迫的基因，且其效应远远超过背景亲本中国春。（2）强烈抑制耐低磷胁迫特性的基因位于5E染色体。（3）2E和3E染色体的附加系与代换系耐低磷特性的表现不一致。尽管2E和3E的附加系对低磷营养胁迫极为敏感，但无论在对照或低磷胁迫条件下，其相应的异代换系却显著优于其附加系和中国春。此外，对附加系和代换系表现不一致的原因进行了讨论。

小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病易位系培育

【目的】将二倍体长穗偃麦草7E染色体导入主栽小麦背景,培育小麦-长穗偃麦草7E染色体抗赤霉病易位系,为小麦抗赤霉病遗传改良利用外源优良基因提供新种质。【方法】利用中国春-长穗偃麦草7E代换系DS7E(7B)与扬麦16杂交的F_2种子进行^(60)Co辐射(30 000 rad)和种植,表现型选择收获存活M_1植株的种子,从M_2连续通过表型农艺性状选择、单花滴注法进行赤霉病抗性鉴定和长穗偃麦草7E染色体或染色体臂特异分子标记PCR扩增筛选,最后在M_4代对中选材料以长穗偃麦草基因组DNA为探针进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)证实。【结果】M_1选择了赤霉病发病率不同的13个单株进行繁殖。利用前期开发的长穗偃麦草7E染色体和7EL、7ES特异标记检测13株的后代M_2单株,获得含有长穗偃麦草7EL片段7株和7ES片段14株;对21株M_2衍生的222个M_3植株进行特异标记检测,共选择含有长穗偃麦草7EL片段13株和7ES片段3株;利用来自12株M_3的后代(M_4)进行GISH,共9株M_3的后代具有小麦-长穗偃麦草易位染色体,体细胞染色体2n=42。2株M_3的后代显示附加2条长穗偃麦草染色体短臂,体细胞染色体2n=44。连续多年多途径的筛选,获得4份材料,3份材料均为长穗偃麦草7E染色体长臂易位系,命名为TW-7EL1、TW-7EL2和TW-7EL3。1份为7E染色体短臂附加系,命名为W-DA7ES,最后所获得的材料是源自M_1代2个单株。连续3年赤霉病抗性鉴定结果表明长穗偃麦草7EL易位系抗性高,发病率明显低于中国春和扬麦16,与苏麦3号相当,而7ES附加系的赤霉病抗性明显较低,发病率明显高于7EL易位系。【结论】通过赤霉病抗性鉴定、染色体特异分子标记筛选和GISH证实相结合培育了小麦-长穗偃麦草7EL抗赤霉病易位系,长穗偃麦草易位片段鉴定快速和准确。二倍体长穗偃麦草7E染色体长臂中含有抗小麦赤霉病的基因。

小麦中国春背景下长穗偃麦草光合作用相关基因的染色体定位

光合作用与小麦产量关系的研究倍受国内外学者关注,而以代换系为材料研究外源染色体对光合作用的效应至今未见报道。笔者以小麦-长穗偃麦草二体代换系为材料,以旗叶为主要测定叶位,用美国CID公司生产的CI-310便携式光合作用测定系统于田间测定旗叶光合速率在各生育期变化,并测定其与产量构成因素间的相关性。结果表明,DS2Ee(2A)代换系在开花期具有在整个生育期最高的光合速率,2Ee染色体可在穗粒数性状的改良过程中加以利用。DS4Ee(4A、4B、4D)代换系其旗叶从抽穗期到灌浆期始终保持较高水平净光合速率,对籽粒形成和充实十分有利,4Ee染色体可在通过改良灌浆时光合速率来提高千粒重等产量指标的研究中加以利用。

不同盐胁迫对长穗偃麦草种子萌发及幼苗生长的影响

采用不同浓度NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3单盐溶液对长穗偃麦草种子进行胁迫处理,测定种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数以及幼苗芽长和根长等指标,研究长穗偃麦草种子在不同盐胁迫条件下的萌发特性。结果表明,与用蒸馏水培养的对照相比,随着NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3单盐浓度的增加,长穗偃麦草种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均呈下降趋势。NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3对胚芽长和胚根长的抑制规律一致,表现为随盐浓度升高抑制作用增强,且胚根比胚芽对盐浓度反应更敏感;但是低浓度NaHCO3对胚根生长有一定的促进作用。4种单盐对长穗偃麦草种子萌发的抑制作用总体表现为:二价盐>一价盐。

基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记

分别以二倍体长穗偃麦草和普通小麦中国春的基因组DNA作实验组和对照组,运用抑制消减杂交(SSH)技术去除2个基因组DNA之间的同源序列,获得长穗偃麦草特异的DNA片段构建的单向抑制消减文库,并对随机克隆测序。根据测序结果设计引物,获得36个长穗偃麦草基因组特异分子标记,成功率高达69.2%。这些标记均能在具有长穗偃麦草E染色体的不同小麦背景和不同世代中稳定表现,可用于小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。

小麦与长穗偃麦草(高冰草)体细胞杂种后代的性状变异及选育

为了解远缘小麦体细胞杂种后代遗传变异的特点,对普通小麦和长穗偃麦草[高冰草Ag ropy ronelong atum Host(N evsk i)]的体细胞杂种后代进行了多年的观察、比较和研究,发现体细胞杂种后代变异谱广泛,变异幅度大(达120%),杂种后代性状稳定时间短,遗传性稳定,杂种后代还出现了多种新的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)。说明将长穗偃麦草的遗传物质通过细胞杂交技术导入了普通小麦,为小麦品质改良提供了优异基因,既丰富了小麦遗传背景,又可使杂种后代较快地稳定,可以利用杂种后代培育出优良品种和种质材料。本研究已培育出几个新品系和不同类型的新种质。

长穗偃麦草DNA导入引起的冬小麦后代性状变异及其遗传研究

为了解外源DNA导入小麦后引起的性状变异及其遗传规律,应用花粉管通道外源DNA导入技术将长穗偃麦草总DNA导入冬小麦陇鉴127中,调查其后代产生的变异,并进行连续选择和抗病性鉴定。结果表明,从D1、D2代开始各性状均产生明显的变异,D3代基本趋于稳定。对陇鉴127的4个变异系的方差齐性检验显示主要性状有明显的变化:株高、旗叶面积、单穗粒数变异程度较大;穗长、千粒重性状比较稳定,不易发生变异;分蘖数具有不一致性和不稳定性,易受环境影响发生变异。抗病性鉴定表明,变异后代有个别表现对条锈病免疫或高抗,部分材料兼抗白粉病。说明个别变异材料中已引入了供体抗锈基因,外源基因已进入冬小麦中并得到表达。研究还表明外源DNA导入冬小麦后引起变异的种类多、范围广、幅度大,具有多样性和复杂性,但不是完全随机的,而是具有重复性和一定的趋向性。

长穗偃麦草酸性磷酸酶与碱性磷酸酶编码基因的染色体定位

以一套中国春-长穗偃麦草二体异附加系与二体异代换系为材料,用等电聚焦(IEF)研究长穗偃麦草基因组中酸性磷酸酶(AcPh)与碱性磷酸酶(APH)编码基因的染色体定位。结果表明,AcPh大多聚焦于pH5～7范围内,其编码基因位于3E染色体,而APH编码基因则位于4E染色体。由于5E染色体的附加,AcPh活性带强度显著减弱。

四倍体长穗偃麦草(Agropyron elongatum 4x)染色体组构成的生化和SSR标记分析

应用等电聚焦(IEF)和SDS PAGE方法分析了二倍体长穗偃麦草(Agropyronelongatum2x)和四倍体长穗偃麦草(Ag.elongatum4x)的16种同工酶和3种贮藏蛋白的电泳图谱。结果表明,只有两种同工酶在四倍体和二倍体长穗偃麦草之间表现相同的酶谱,该类型仅占分析标记总数的10.5%;而10种同工酶和3种贮藏蛋白的电泳图谱在四倍体中除了具有全部二倍体的谱带以外,还有自己独特的条带,该类型最多,占分析标记总数的63.2%;另外5种同工酶在二倍体和四倍体之间只有部分条带相同,同时具有各自特异的条带,该类型占分析标记总数的26.3%。由此推测,四倍体长穗偃麦草可能是一个异源四倍体,即只含有一个起源于二倍体类型的染色体组Ee,而另一个染色体组在所分析的生化标记上明显不同于近缘种中的St、J和N染色体组,其起源尚待进一步研究。进一步用小麦的SSR引物对二倍体和四倍体长穗偃麦草进行扩增,结果表明大多数SSR引物在四倍体中既能扩出与二倍体相同的条带,同时还有其特异的条带,这一结果验证了由生化标记得出的四倍体长穗偃麦草是异源四倍体的初步结论。

利用杀配子染色体2C诱导中国春-长穗偃麦草1E二体附加系染色体畸变的研究

偃麦草属具有许多优良的遗传性状,利用杀配子染色体诱导小麦-偃麦草的染色体易位,是创建小麦异源易位系、丰富小麦遗传资源的一个有效途径。杀配子染色体2C在单体附加时,可高效率地诱导染色体畸变,得到易位、缺失等畸变类型。本研究利用含有杀配子染色体的中国春-柱穗山羊草2C(Ae.Cylindrical2n=28CCDD)二体附加系与中国春-长穗偃麦草(E.elongate2n=14EE)1E二体附加系杂交。观察F1花粉母细胞减数分裂情况,发现存在到量的染色体异常行为。单价体数超过理论值,棒状二价体数明显增加,并出现一定频率的三价体和四价体,及大量的染色体断片、染色体桥和落后染色体、微核,并伴随发生多极分裂现象。经C-分带与荧光原位分子杂交鉴定83株杂交F2,共检测到5株易位、6株缺失。易位频率为6.02%,缺失率为7.22%,染色体畸变的总频率为13.24%。并对杀配子染色体的诱变机制及引起杂交后代结实率降低的原因进行了讨论。

长穗偃麦草优异基因的染色体定位及应用

长穗偃麦草比较公认的有2个种,即二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum,2n=2X)和十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum,2n=10X),是重要的小麦近缘种,具有抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱等优良性状。因其基因组中蕴含许多对小麦品种改良极为有用的基因,且易与小麦杂交等优势,多年来长穗偃麦草一直作为小麦遗传改良的优良种质资源而备受关注。本文对长穗偃麦草的基因组研究及其在小麦的抗逆、抗病和提高光合能力、产量及高分子量谷蛋白(HMW-GS)含量等方面的应用做了综述,为其基因组中优异基因的进一步开发和利用提供了理论依据。

长穗偃麦草E组染色体对小麦光合速率和产量性状的效应

以中国春-二倍体长穗偃麦草附加系、置换系为材料,在不同生育期测定其旗叶光合速率,收获期考察相关产量性状,并分析光合速率与产量构成因素的相关性,从而对长穗偃麦草影响小麦光合速率和产量的相关遗传基础进行染色体定位。结果表明:长穗偃麦草的2E及6E染色体对提高小麦旗叶光合速率的效应明显,而5E染色体却具有负作用,3E、4E及6E染色体上可能存在对提高小麦产量有利的基因。

基于TRAP的长穗偃麦草SCAR标记的开发及应用

为了开发长穗偃麦草的特异标记,依据TRAP技术,利用56对固定引物与随机引物的组合对中国春-长穗偃麦草附加系等材料进行PCR扩增,共筛选出160条分布于长穗偃麦草1E-7E染色体的特异扩增片段。通过对104个片段的序列进行同源比对,选择与小麦无同源序列的区段设计138对引物,分别对中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草附加系进行PCR扩增,最终获得30个长穗偃麦草特异SCAR标记,发展标记的效率为53.6%。利用这些特异SCAR标记对硬粒小麦(AABB)与异源六倍体小麦(AABBEE)杂交产生的F2中38个单株进行扩增鉴定,9个单株仅附加了1条相同的E染色体,其余为多条E染色体或者无E染色体附加。这些SCAR标记在不同材料和世代表现出优越的特异性和稳定性,可用于检测小麦背景中附加的相关长穗偃麦草染色体。