应用GFP质粒构建及转染技术探讨Syk(L)核移位机制

【目的】通过研究Syk(L)在乳腺癌细胞亚细胞器中的分布和移位机制,探讨Syk(L)抑制乳腺癌的可能性机制。【方法】采用细胞胞核、胞浆分离技术和Westernblot的方法,检测乳腺癌细胞系BT474中两种Syk蛋白异构体在细胞内的分布。构建绿色荧光蛋白(GFP)和Syk(L)核移位相关功能域融合蛋白质粒,转染入Cos7细胞内,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的分布。【结果】BT474细胞的细胞浆中可检测到Syk(S)和Syk(L)的表达,细胞核中只检测到Syk(L)的表达。在Cos7细胞中,GFP与Syk(L)的缺失域(deletiondomain,DEL域)融合蛋白均匀分布于细胞内,GFP与Syk(L)的IDB域融合蛋白聚集于细胞核中;将DEL域上的294K、300K、及305K突变域非碱性氨基酸后构建成GFP-IDB(L)-M,突变的融合蛋白则失去核聚集现象。【结论】在乳腺癌细胞中,Syk(L)可从细胞胞浆移位到细胞核内。Syk(L)的IDB域具有完整的核移位功能,能将融合的胞浆蛋白GFP转移到细胞核内;DEL域的碱性氨基酸具有核定位信号功能。Syk(L)在乳腺癌细胞中的抑癌功能与其核移位有关。