长臂同源多聚酶链反应法构建变形链球菌comD基因同源重组DNA片段

目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因同源重组DNA片段,为利用同源重组原理构建基因功能丧失菌株做准备。方法通过NCBI基因数据库获取变形链球菌的DNA序列,利用聚合酶链反应技术分别扩增变形链球菌UA159comD基因上、下游片段及抗红霉素基因片段,再通过长臂同源多聚酶链反应将这3个片段连接起来,形成同源重组DNA片段。结果经过PCR反应和琼脂电泳分析,得到了一个碱基数为3个单片段总和的连接片段,测序结果显示连接片段为预期的comD同源重组片段。结论成功构建了变形链球菌UA159comD基因同源重组DNA片段,可直接用于细菌转化构建comD基因缺陷菌株。

聚合酶链反应直接检测粪便中志贺菌的临床意义

近年来志贺菌在众多的腹泻病致病菌中仍然具有较高的发病率[1].在基层部队常常引起急性细菌性痢疾(急性菌痢),并时呈集体暴发流行.应用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌已早有报道,但应用于临床实际诊断的研究报道不多.本文采用PCR和长臂光敏生物素探针杂交技术对2起急性菌痢,共17例进行了检测,进一步探讨PCR用于临床腹泻病诊断的实用性.

宁夏大学生示指和环指指长比与同源盒A11基因位点多态性的关联性

目的探讨宁夏大学生示指和环指指长比(2D∶4D)与同源盒(HOX)A11基因4个位点(rs6461992、rs6968828、rs7801581、rs17427875)多态性的关联性。方法采用数码相机提取667名宁夏汉族大学生(男性348名,女性319名)手部正面照片,图像分析软件标记解剖点并测量双手示指及环指指长;多重PCR法检测HOXA11基因各位点多态性;统计学软件比较分析2D∶4D和基因多态性在不同性别间的差异及其关联。结果宁夏汉族大学生女性左手和右手2D∶4D均显著高于男性(均P<0.05),右手-左手2D∶4D性别差异不显著;HOXA11基因rs7801581位点基因型、等位基因频率在不同性别间差异显著(均P<0.05),其他位点多态性在性别间的差异均无统计学意义;2D∶4D与HOXA11基因位点多态性关系中,仅女性左手2D∶4D与rs6461992位点基因型显著关联(P<0.05)。结论宁夏汉族大学生2D∶4D性别间差异显著,HOXA11基因rs6461992位点多态性可能与女性2D∶4D的形成有关。

人生长激素基因在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的 :将人生长激素基因构建至pHSS6 mTn 3×HA/lacZ转座文库载体中 ,利用酿酒酵母同源重组稳定高效表达人生长激素。 方法 :通过两步PCR获得带有信号肽的目的基因 ,插入到文库载体的Sse8387I位点中 ,NotI酶切 ,酵母同源重组 ,SC Ura筛选 ,酵母菌落PCR及lacZ基因表达初步鉴定阳性重组子。 结果 :酵母菌落PCR初步鉴定 ,筛选出目的基因正确插入的重组子 ,其中两株有lacZ基因高表达。 结论 :对阳性重组子进行lacZ显色反应 ,筛选出可高水平表达x gal的菌株 ,以此推测重组位点前有强启动子 ,为目的基因的稳定高效表达奠定基础。

PCR结合长臂光敏生物素探针检测粪便中志贺氏菌

本文报告了聚合酶链反应(PCR)结合长臂光敏生物素探针检测出腹泻病患者粪便中志贺氏菌。选择志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌(EIEC)共有的DNA序列;质粒编码的侵袭相关焦点(ial)作为靶序列,PCR检测9株志贺氏菌,均扩增出320bp DNA片段,。19株非志贺氏菌均阴性。敏感试验显示其最小检菌量为100 cfu。58份粪际本中,23份阳性(39.6％),粪培养18份阳性(31％)。PCR敏感性高于粪培养8.6％。

示-环指长比与6个指骨发育相关基因多态性的关联性

目的探讨6个指骨发育相关基因,即成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、印度刺猬信号分子(IHH)、Msh同源盒1(MSX1)、Runx家族转录因子2(RUNX2)、SRY盒转录因子9(SOX9)及Wnt家族成员5A(WNT5A)13个位点单核苷酸多态性(SNP)与人类示-环指长比(2D∶4D)的关联性。方法采用数码相机拍摄宁夏地区731名在校大学生(男性358名,女性373名)手部正面照片,采用GraphPad Prism 8.0图像分析软件标记解剖点并测量示(2)指及环(4)指指长;多重PCR法进行6个基因13个SNP位点(rs1047057、rs755793、rs41258305、rs3731881、rs3100776、rs12532、rs3821949、rs45585135、rs3749863、rs1042667、rs12601701、rs1829556和rs3732750)的基因分型;单因素方差分析或独立样本t检验间接评估2D∶4D与13个SNP位点间的关联性。结果宁夏大学生女性左手和右手2D∶4D均显著高于男性(均P<0.01);13个SNP位点基因型、等位基因频率在不同性别间的差异均无显著统计学意义(均P>0.05);不同性别中,男性左手2D∶4D与SOX9基因rs12601701位点基因型显著关联(P<0.05),右手2D∶4D与WNT5A基因rs1829556位点基因型显著关联(P<0.05);女性右手2D∶4D与MSX1基因rs12532(P<0.01)和rs3821949(P<0.05)位点基因型显著关联。结论SOX9(rs12601701)、WNT5A(rs1829556)、MSX1(rs12532和rs3821949)基因多态性可能与宁夏地区人群2D∶4D的形成有关。

肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)dnaJ基因缺陷菌株,并对其毒力作初步研究。方法采用长臂同源多聚酶链式反应(long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)技术将dnaJ基因替换为红霉素耐药基因(erm)后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出dnaJ缺陷菌株。用PCR鉴定缺陷菌株,以细菌的吸光度值D(600 nm)观察体外缺陷菌株生长情况。将44只BALB/c小鼠采用随机数字表法分为2组,分别用野生菌株和缺陷菌株处理,腹腔攻毒100μl高(2×108cfu)、低(2×106cfu)剂量的菌液,各处理组的不同剂量组均有11只小鼠。记录小鼠死亡时间,计算存活率。60只BALB/c小鼠采用随机数字表分为2组,分别鼻腔滴注含菌量为2×107 cfu的30μl D39菌液和△dnaJ菌液,感染后6、12、24、36、48 h处死每组中的5只小鼠,分别取鼻咽灌洗液、肺组织(匀浆)和心脏血培养,根据每组平均菌落计数结果绘制细菌在宿主体内的定植曲线。结果 PCR结果显示dnaJ基因完全被erm基因所替代,构建dnaJ缺陷菌成功;单个菌落培养基生长情况表明体外热休克状态抑制dnaJ缺陷菌生长;小鼠毒力实验显示腹腔感染缺陷菌株的小鼠存活率可达到100%,而感染野生菌株的小鼠全部死亡,两者比较有统计学差异(P<0.01)。小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株在各时间点鼻咽灌洗液和肺部的细菌载量均显著低于野生菌株,而且入血后可在感染24 h内被宿主清除,上述差异有统计学意义(P<0.01)。结论采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代dnaJ基因,方法简便快捷;dnaJ的缺陷影响细菌在体外应激条件下的生长,并显著降低细菌在宿主体内的毒力和定植。

乙型肝炎病毒E抗原结合蛋白E-19的猴同源基因的克隆化与序列分析

目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为他与HBV引起免疫耐受,免疫系统功能障碍有关.应用酵母双杂交技术我们克隆了人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因E-19,应用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因. 方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,提取阳性菌落并测序,确定人E-19基因序列,利用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因,并进行编码产物的序列分析. 结果:成功克隆出人的HBeAg结合蛋白新基因E-19.应用生物信息学技术,确定克隆了猴E-19同源基因,编码基因全长378 nt,编码产物由125 aa组成. 结论:成功克隆出人的HBeAg的肝细胞结合蛋白E-19基因,并发现、确定了猴E-19的同源基因,为研究E-19 基因的结构与功能、表达与调控、生物学意义以及在病毒性肝炎发病机制中的作用奠定了基础.

应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆As2O3调节相关基因,阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以As2O3处理HepG2细胞,同时以PBS处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌J109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到109个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因. 结论:应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

HepG2.2.15细胞株中乙型肝炎病毒基因异质性的研究

目的以乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因异质性来探讨在HepG2.2.15细胞体内是否存在HBV准种。方法依据Genebank中HBVayw亚型全基因序列,选择保守区域设计出特异性多聚酶链反应引物,自HepG2.2.15细胞培养上清中扩增HBV前C/C基因序列,克隆入pGEM-TEasy载体,挑选15个克隆测序以比较病毒的变异程度。结果测序结果发现HepG2.2.15细胞HBV前C/C基因存在异质性,碱基序列之间的同源性大于93%,突变类型全部为碱基替换。结论结果提示,长期培养HepG2.2.15细胞内有HBV准种共存,这种细胞模型内HBV异质性现象可能影响其在基因治疗等方面的应用。

PCR在沙门氏菌肠炎快速诊断中的应用

选择沙门氏菌共同的侵袭基因(invA)作为靶序列,用聚合酶链反应(PCR)直接检测腹泻病粪便中沙门氏菌。PCR检测10株沙门氏菌,均扩增出invA基因中284bp DNA片段,20株非沙门氏菌均阴性。敏感试验显示,其最小检菌量为8个细菌/ml,DNA最小检出量为100fg。PCR检测84份腹泻粪标本,13份阳性,其中10份粪培养阳性,3份粪培养阴性。

LncRNA FTX对慢性髓细胞性白血病细胞伊马替尼抵抗的影响及机制研究

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)FTX对慢性髓细胞性白血病(CML)伊马替尼(Imatinib)抵抗的影响及可能机制。方法梯度诱导CML细胞K562伊马替尼抵抗的形成(抵抗组),采用等体积生理盐水处理CML细胞K562(敏感组),对处于对数生长期的抵抗组细胞转染LncRNA FTX-siRNA(转染组),对处于对数生长期的抵抗组细胞转染空白对照载体(对照组)。采用逆转录聚合酶链反应(PCR)检测抵抗组和敏感组细胞中LncRNA FTX的相对表达量以及转染组和对照组细胞中多聚嘧啶序列结合蛋白1(PTBP1)mRNA的表达水平,CCK-8法检测伊马替尼对4组细胞的半抑制浓度(IC50),蛋白质印迹法(Western blot)检测4组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量。结果抵抗组细胞中LncRNA FTX的相对表达量明显高于敏感组(P﹤0.01);伊马替尼对抵抗组细胞的IC50值明显高于敏感组,对转染组细胞的IC50值明显低于对照组(P﹤0.01);抵抗组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量明显高于敏感组,转染组细胞中PTBP1蛋白的相对表达量明显低于对照组(P﹤0.01);转染组和对照组细胞中PTBP1 mRNA的相对表达量比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论 LncRNA FTX可通过抑制PTBP1蛋白的表达,介导CML细胞伊马替尼抵抗的形成。

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能. 方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI 酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行茵落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列. 结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.

大鼠坐骨神经缺损后背根神经节组织lncRNA表达变化

目的:研究大鼠坐骨神经缺损后背根神经节中长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的表达变化。方法:建立SD大鼠坐骨神经损伤0天、1天、4天和7天模型,取背根神经节组织进行lncRNA检测,进行差异基因的筛选,并应用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(qRT-PCR)对芯片结果进行验证;利用lncRNA与mRNA特异性表达的标准化信号强度,构建基因共表达网络。结果:共筛选出24个显著下调的lncRNAs,qRT-PCR检测的lncRNA AF130881和AB020616的表达变化与芯片一致。得到与lncRNA AF130881和AB020616正向或负向共表达的蛋白编码基因25个。结论:大鼠坐骨神经缺损后背根神经节组织中lncRNA的表达谱发生改变。

肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的 构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）溶血素基因（pneumolysin,ply）缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）技术将ply基因替换为红霉素耐药基因（erm）后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功 单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响 但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间（6 h）明显晚于野生菌株（2 h）,且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01） 小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷 ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭.

替代失活法构建变形链球菌LuxS基因缺陷株

目的 LuxS基因是变形链球菌生物膜早期形成过程中的关键基因,构建该基因的缺陷菌。方法采用长臂同源多聚酶链反应(LFH-PCR)方法构建含红霉素耐药基因片段的LuxS基因上、下游同源序列的连接片段,转化到变形链球菌中,在红霉素的平板上筛选缺陷菌株,并采用PCR鉴定。结果对变形链球菌LuxS基因缺陷菌株进行PCR和DNA序列测定分析证实构建成功。结论成功构建出变形链球菌LuxS基因的缺陷菌株,为后期针对变形链球菌LuxS基因的相关研究奠定基础。