单纯疱疹病毒介导GALV致融性糖蛋白对人肺腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)载体介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因转导肺腺癌细胞的体内抗肿瘤作用及建立人肺腺癌皮下瘤裸鼠模型的最佳方案。方法将重组HSV-Ⅰ载体质粒通过脂质体导入非洲绿猴肾细胞(Vero)中包装制备重组HSV-Ⅰ病毒,通过细胞悬液接种或组织块移植法构建人肺腺癌细胞(A549)裸鼠皮下移植瘤模型,将重组HSV-Ⅰ病毒注入裸鼠肺癌瘤体中观察其体内抗肿瘤作用。结果成功包装重组HSV-Ⅰ病毒,病毒对肺癌细胞有明显的杀灭作用且对裸鼠皮下肺癌转移灶抑制明显。结论细胞悬液接种和套管针组织块接种均为建立裸鼠荷瘤模型理想方法;GALV.fus基因对肺癌细胞有强效的抗肿瘤作用,明显抑制人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长,为临床肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法。

GALV致融性糖蛋白转导肺腺癌细胞的抗肿瘤实验研究

目的探讨特异性启动子控制下嗜肿瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)载体介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因转导肺腺癌细胞的抗肿瘤作用。方法将重组HSV-Ⅰ载体质粒通过脂质体导入非洲绿猴肾细胞(Vero)中包装制备重组HSV-Ⅰ病毒,用来转染肺腺癌细胞(A549)和正常人胚胎成纤维细胞(HFL-ⅠGNHu5)及裸鼠皮下肺癌转移模型,观察其体外及体内抗肿瘤作用及细胞毒性作用。统计学方法采用t检验。结果成功包装重组HSV-Ⅰ病毒,BALB/c裸鼠皮下接种A549细胞2周后均有肿瘤生长,成瘤率为100%。重组单纯疱疹病毒能特异性转染A549细胞,治疗组及对照组细胞存活率分别为20%及70%,病毒对A549细胞有明显的杀灭作用且对裸鼠皮下肺癌转移灶抑制明显。结论GALV.fus基因对肺癌细胞有强效的抗肿瘤作用,为临床肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法。

嗜肿瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒介导GALV fus基因治疗肺腺癌的体外试验研究

目的:探讨特异性启动子UL38及无肿瘤特异性巨细胞病毒启动子(CMVP)调控的嗜肿瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因系统体外对人肺腺癌的选择性杀伤效应。方法:选择非洲绿猴肾细胞(Vero),肺腺癌细胞(A549)和正常人胚胎成纤维细胞(HFL-Ⅰ GNHu 5),将构建成功的重组HSV-Ⅰ载体通过脂质体转染、导入包装细胞Vero中制备重组HSV-Ⅰ病毒,用来转染A549和HFL-Ⅰ GNHu 5,观察其转染、表达状况及体外抗肿瘤作用,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段取代GALV.fus作对照质粒。提取受染A549和HFL-Ⅰ GNHu 5细胞的总蛋白,以Western Blot法鉴定GALV.fus基因的表达。结果:成功包装重组HSV-Ⅰ载体,致融性病毒感染A549后引起强烈的细胞膜融合,且杀伤作用随着感染剂量的增加而增强。而非致融病毒仅引起病毒细胞毒性效应,细胞呈圆形,镜下未见细胞融合斑。CMVP调控的重组HSV-Ⅰ在HFL-ⅠGNHu 5生长静止抑制状态均引起细胞膜融合,UL38P调控的重组HSV-Ⅰ仅在生长状态导致细胞膜融合;而细胞处于静止和抑制状态时,不引起细胞膜融合以及任何细胞病理改变。以Western Blot法检测受染A549和HFL-Ⅰ GNHu 5细胞,均可检到GALV.fus基因蛋白表达。结论:UL38p调控的GALV.fus基因在有效的载体内对体外肺癌细胞有强效的选择性杀伤效果和应用安全性,为临床肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法。

携带GALV.fus基因的重组单纯疱疹病毒的组装、扩增及鉴定

目的:包装已成功构建的受Ⅰ型单纯疱疹病毒(HerpessimplexvirusⅠ,HSV-Ⅰ)晚期表达基因-UL38启动子调控的、嗜肿瘤单纯疱疹病毒介导的,长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(Gibbon ape leukemia virus membrance fusion glycopratein,GALV.fus)基因质粒(HSV-UL38P-GALV.fus),无肿瘤特异性巨细胞病毒启动子(Cytomegalovirus promoter,CMVP)GALV.fus质粒(HSV-CMVP-GALV.fus),GALV.fus基因片段被增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因片段所取代的治疗对照质粒(HSV-CMVP-EGFP),分别命名为Synco-2、Synco-1、Baco-1。方法:扩增已成功构建的HSV-UL38P-GALV.fus、HSV-CMVP-GALV.fus、HSV-CMVP-EGFP质粒,然后分别在Vero细胞用脂质体转染、包装成重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒。重组单纯疱疹病毒的扩增及纯化采用Vero细胞及氯化铯纯化常规方法,病毒滴度测定采用TCID50法。Synco-1、Synco-2病毒感染肝癌细胞株HepG2,分别提取受染肝癌细胞HepG2的总RNA,以RT-PCR的方法鉴定GALV.fus基因的表达。结果:成功包装了3种重组单纯疱疹病毒Baco-1、Synco-1和Synco-2,按需要在Vero细胞内扩增后以氯化铯密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测得病毒滴度分别为3×1010 pfu/ml1,×1011 pfu/ml和4×1010 pfu/ml。受染肝癌细胞株HepG2中以RT-PCR法检测到GALV.fus基因的表达。结论:成功包装、扩增及纯化3种重组单纯疱疹病毒,受染肝癌细胞株HepG2中以RT-PCR法检测到GALV.fus基因的表达。

携带GALV. fus基因的重组单纯疱疹病毒-Ⅰ的构建及抗肺腺癌裸鼠荷瘤实验研究

目的探讨重组单纯疱疹病毒-Ⅰ(HSV-Ⅰ)介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因系统对肺腺癌的体内外杀伤效果。方法扩增已成功构建的HSV-UL38P-GALV.fus、HSV-CMVP-GALV.fus、HSV-CMVP-EGFP质粒,在Vero细胞用脂质体转染、包装成重组嗜肿瘤HSV-Ⅰ,分别命名为Synco-2、Synco-1、Baco-1。重组HSV-Ⅰ的纯化采用氯化铯纯化法,病毒滴度测定采用半数组织培养感染剂量法(TCID50)。将构建成功的重组HSV-Ⅰ体外转染肺腺癌细胞(A549)及裸鼠转移瘤模型,模型分A(Control)组、B(Baco-1)组、C(Synco-1)组、D(Synco-2)组、E(Synco-2)组,观察其转染、表达状况及体内外抗肿瘤作用。结果成功包装了3种重组HSV-Ⅰ,TCID50法测得病毒滴度分别为3×1010pfu/mL、1×1011pfu/mL和4×1010pfu/mL。重组病毒对A549细胞有明显的杀灭作用,Synco-1、Synco-2组各时点细胞存活率均低于Baco-1组(P<0.01)。C、D组裸鼠肿瘤体积于第1周及以后各时点小于A、B组(P<0.01);C、D组间前3周肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05),4、5周D组小于C组(P<0.01)。第5周C组〔(0.544±0.07)g〕、D组〔(0.467±0.09)g〕肿瘤质量与A组〔(2.412±0.55)g〕及B组〔(1.522±0.61)g〕相比减轻(P<0.01),C、D组间差异亦有统计学意义(P<0.01)。结论成功包装、扩增及纯化3种重组HSV-Ⅰ,重组GALV.fus基因系统在有效的载体及特异性启动子调控下在体内外对肺癌细胞有强效的抗肿瘤作用,为肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法。