长链非编码RNA组蛋白去乙酰化酶3通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路调控肝癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡

目的研究长链非编码RNA组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的调控机制。方法运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测正常肝细胞MIHA、肝细胞癌细胞SK-Hep1中HDAC3的表达;将si-NC组(转染si-NC)、si-HDAC3组(转染si-HDAC3)、si-HDAC3+DMSO组[转染si-HDAC3并用二甲基亚砜(DMSO)处理]、si-HDAC3+MHY1485组[转染si-HDAC3并用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路抑制剂MHY1485处理]用脂质体法转染至SKHep1细胞;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室检测细胞迁移侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法(Westernblotting)检测细胞中Akt激酶、翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)、核糖体p70S6激酶蛋白(S6K1)、磷酸化核糖体p70S6激酶蛋白(p-S6K1)的蛋白表达。结果与正常肝细胞MIHA(1.00±0.06)相比,肝细胞癌细胞SK-Hep1中HDAC3表达(4.38±0.34)显著上调(P<0.05)。敲减HDAC3后,SK-Hep1细胞的增殖、迁移、侵袭能力均得到明显下调,凋亡能力得到明显上调。有趣的是,敲减HDAC3后,SK-Hep1细胞中mTOR信号通路关键基因Akt、4E-BP1、p-S6K1的表达均明显下调,并且激活mTOR信号通路可部分逆转敲减HDAC3对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡调控作用。结论长链非编码RNAHDAC3可调控肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,其机制可能与mTOR信号通路相关,可为肝癌的治疗提供新的作用靶点。

胃癌组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化修饰相关长链非编码RNA预后模型的构建与验证

目的 探索胃癌组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化(trimethylation of lysine 4 on histone H3,H3K4me3)修饰相关长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)特征,构建相关预后模型并预测胃癌免疫治疗疗效。方法 从癌症基因组图谱数据库下载胃癌相关转录组测序数据和对应的患者临床资料,通过构建H3K4me3相关调节因子基因与LncRNA的共表达网络识别H3K4me3修饰相关LncRNA,并将癌症基因组图谱数据库中370例符合筛选标准的胃癌患者样本(整体组)按1:1随机抽样划分为训练组(n=185)和验证组(n=185)。随后基于单因素Cox回归、Lasoo回归分析构建H3K4me3相关LncRNA预后风险评分模型并进行内部验证。Kaplan-Meier生存分析和受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)被用于验证模型的预测性能。通过单因素和多因素Cox回归分析评估风险评分等临床指标的预后预测价值。结合风险评分、年龄和肿瘤TNM分期构建预测胃癌患者总生存率的列线图模型,ROC曲线与校准图被用于评估列线图的预测准确性。借助共识聚类识别异质性聚类亚群并进行免疫治疗疗效预测。结果 基于共表达网络关系识别了14个具有预后价值的H3K4me3相关LncRNA并构建了相关风险模型及评价体系。根据训练组预后风险评分模型获得的中位风险评分将训练组、验证组和整体组胃癌患者划分为高、低风险,Kaplan-Meier生存曲线显示低风险患者的总体生存情况要优于高风险患者(P<0.05)。此外,该模型在训练组中预测胃癌患者1、3、5年总生存率的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.708、0.730、0.770,在验证组中分别为0.690、0.648、0.713,而在整体组中分别为0.697、0.670、0.724。多因素Cox回归分析显示基于H3K4me3相关LncRNA构建的风险评分模型是预测胃癌患者预后的独立因素(P<0.001)。构建的列线图预测胃癌患者1、2、3年总生存率的AUC分别为0.727、0.780、0.717,且其校准曲线与理想曲线相接近。基于共识聚类算法进一步识别了2种具有异质性免疫特征的H3K4me3-LncRNA亚群,其中亚组Ⅱ具有更高的免疫细胞浸润水平和更强的免疫应答潜力,并对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂等显示出更高的药物敏感性,而亚组Ⅰ则可能对磷脂酰肌醇3-激酶特异性抑制剂具有更高的敏感性。结论 本研究构建了一个H3K4me3-LncRNA风险评分模型以预测胃癌患者的预后,并揭示了其异质性微观特征及在预测免疫治疗疗效方面的潜在价值。

METTL3介导m6A修饰长链非编码RNA THAP7-AS1表达上调促进肺癌发生的作用及机制研究

背景与目的肺癌是对人类健康的一大威胁,有关肺癌发生发展的分子机制复杂且知之尚少,探索与肺癌发展相关的分子标志物有利于提高早期诊断和治疗的效果。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)THAP7-AS1已知在胃癌中高表达,但在其他癌症中研究较少。本研究旨在探究甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)介导N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰lncRNA THAP7-AS1表达上调促进肺癌发生的作用及机制。方法收集120例肺癌与对应癌旁组织样本,lncRNA微阵列分析差异表达的lncRNA,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测肺癌、癌旁组织、肺癌细胞系THAP7-AS1表达,分析THAP7-AS1对肺癌的诊断价值以及其表达水平与肺癌患者生存率、临床病理特征的关系。通过生物信息学分析、甲基化RNA免疫共沉淀(methylated RNA immunoprecipitation,meRIP)、RNA pulldown实验、RIP实验探究THAP7-AS1的分子调节机制;通过MTS、克隆形成、划痕、Transwell、体内异种移植实验测定各组SPC-A-1、NCI-H1299细胞增殖、迁移、侵袭、成瘤能力,Western blot检测磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kenase B,PI3K/AKT)信号通路蛋白表达。结果肺癌组织、细胞系THAP7-AS1表达升高(P<0.05),对肺癌具有一定的诊断价值[曲线下面积(area under the curve,AUC)=0.737],其表达水平与患者总生存率、肿瘤大小、肿瘤原发灶-淋巴结-转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。METTL3介导的m6A修饰能够增强THAP7-AS1表达。与SPC-A-1、NCI-H1299细胞NC组、sh-NC组相比,THAP7-AS1组增殖、迁移、侵袭能力提高(P<0.05),移植瘤体积、质量增大(P<0.05),sh-THAP7-AS1组增殖、迁移、侵袭能力下降(P<0.05)。THAP7-AS1与Cullin蛋白4B(Cullin 4B,CUL4B)存在特异结合。与SPC-A-1、NCI-H1299细胞Vector组相比,THAP7-AS1组增殖、迁移、侵袭能力、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PI3KCA)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(phosphoinositide-3 kinase-catalytic subunit delta,PI3KCD)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phospho-phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、磷酸蛋白激酶B(phospho-protein kinase B,p-AKT)、磷酸哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphomammalian target of rapamycin,p-mTOR)表达水平升高(P<0.05)。结论LncRNA THAP7-AS1通过METTL3介导的m6A修饰稳定表达,与CUL4B结合激活PI3K/AKT信号通路,促进肺癌发生发展。

长链非编码RNA OTUD6B-AS1、微RNA-365a-3p在肝癌中表达与临床病理特征及预后的关系

目的探究血清及肝癌组织中长链非编码RNA(LncRNA)人去泛素化酶含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA1(OTUD6B-AS1)、微RNA-365a-3p(miR-365a-3p)的表达水平与肝癌病人临床病理特征及预后的关系。方法纳入2015年3月至2017年3月海南医学院第一附属医院收治的肝癌病人86例(肝癌病人组),同时募集同期体检的健康志愿者86例(健康对照组),收集所有研究对象的临床资料。采用qRT-PCR法检测血清及肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达;Star⁃base数据库预测LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间的关系;使用Pearson分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达的相关性;绘制Kaplan-Meier生存曲线分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与病人5年生存率之间的关系;Cox回归分析肝癌病人预后的影响因素。结果与健康对照组比较,肝癌病人组血清中LncRNA OTUD6B-AS1高表达(1.59±0.41比1.02±0.32),miR-365a-3p低表达(0.42±0.15比1.05±0.26)(P<0.05)。肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1表达水平高于癌旁组织(1.70±0.44比0.97±0.16),miR-365a-3p表达水平低于癌旁组织(0.53±0.17比1.01±0.14)(P<0.05)。血清中Ln⁃cRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与TNM期、淋巴结转移以及分化程度相关(P<0.05)。生物信息学预测显示LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间存在靶向结合位点。Pearson分析显示,肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达存在负相关(r=−0.47,P<0.05)。LncRNA OTUD6B-AS1低表达组肝癌病人的5年生存率高于LncRNA OTUD6B-AS1高表达组(37.21%比13.95%,χ^(2)=6.11,P=0.013);miR-365a-3p高表达组肝癌病人的5年生存率高于miR-365a-3p低表达组(41.86%比9.30%,χ^(2)=8.03,P=0.005)。LncRNA OTUD6B-AS1高表达以及miR-365a-3p低表达是影响肝癌病人死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p在肝癌病人血清及肝癌组织中分别呈高、低表达,二者均与TNM期、淋巴结转移、分化程度等临床病理特征以及预后有关。

长链非编码RNA MYU对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其机制

目的探讨长链非编码RNA MYU对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其机制。方法检测长链非编码RNA MYU在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达差异,将Hela细胞株分为:1组:转染对照NC序列;2组:转染MYU siRNA;3组:转染对照pc DNA3.1;4组:转染pc DNA3.1-MYU过表达序列。采用CCK-8法检测各组细胞细胞增殖活力,Western blotting和RT-PCR检测c-myc、CDK4、CDK6基因mRNA及蛋白的表达,采用RNA结合蛋白免疫沉淀试验验证WDR5与MYU的结合,染色质免疫沉淀试验检测组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平。结果癌组织LncRNA MYU的表达量高于癌旁组织(P<0.05);转染24、48 h,OD值比较,2组低于1组,4组高于3组,P均<0.05;Ki-67阳性细胞所占百分比比较,1组高于2组,3组低于4组,P均<0.05;c-myc、CDK4、CDK6mRNA及蛋白比较,1组高于2组,3组低于4组,P均<0.05;LncRNA MYU与WDR5的富集量高于阴性对照(P<0.05);H3K4me3水平比较,1组低于2组,3组高于4组,P均<0.05。结论长链非编码RNA MYU通过募集WDR5抑制c-myc基因启动子区H3K4me3,上调c-myc转录从而促进Hela细胞增殖。

长链非编码RNA H19和转录因子SIRT6在口腔鳞癌中的表达及其与预后的关系

目的研究长链非编码RNAH19(LncRNAH19)和转录因子去乙酰化酶6(SIRT6)在口腔鳞癌中的表达及临床意义。方法纳入2014年11月–2015年5月我院收治的89例口腔鳞癌患者作为研究对象,并以手术切除的口腔鳞癌组织为口腔鳞癌组,以癌旁组织作为正常组。采用实时定量PCR检测LncRNA H19与SIRT6表达水平,免疫组化法检测SIRT6蛋白表达,收集患者临床病理资料,根据口腔鳞癌组检测结果中位值将LncRNA H19分为高表达组与低表达组,观察LncRNAH19、SIRT6表达与患者临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier生存曲线、Log-Rank检验分析LncRNAH19与SIRT6相对表达量对患者预后的影响。结果与正常组相比,口腔鳞癌组LncRNA H19表达水平显著升高(P <0.05),而SIRT6 mRNA与蛋白表达显著降低(P <0.05);LncRNA H19、SIRT6均与淋巴结转移、TNM分期、分化程度显著相关(P <0.05);Kaplan-Meier分析结果显示,LncRNA H19低表达组无进展生存期、总体生存时间显著高于高表达组(P <0.05),SIRT6阳性表达组无进展生存期、总体生存时间显著高于阴性表达组(P <0.05)。结论口腔鳞癌组织中LncRNAH19高表达,而SIRT6低表达,两者均与口腔鳞癌的发生发展及预后有关,且均可成为临床早期诊断与治疗的潜在靶标。

LncRNA MALAT-1靶向microRNA-370-3p调节Akt通路对肺癌细胞生物学行为影响的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子-1(LncRNA MALAT-1)是否能靶向调节microRNA-370-3p(miR-370-3p)的表达,以及对Akt通路和肺癌细胞生物学行为的影响。方法 选用非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞体外培养,分别抑制LncRNA MALAT-1(转染si-MALAT-1)或过表达miR-370-3p(转染miR-370-3p mimic),抑制LncRNA MALAT-1和干扰miR-370-3p(同时转染si-MALAT-1和antimiR-370-3p),观察A549细胞的生物学行为和Akt通路蛋白的表达。qRT-PCR检测LncRNA MALAT-1、miR-370-3p mRNA的表达;MMT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移与侵袭;Western blotting检测Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白相对表达量。构建MALAT-1野生型(MALAT-1WT_1uc)与突变型(MALAT-1MUT_1uc)荧光素酶报告基因质粒并分别与miR-370-3p、miR-NC转染至A549细胞,观察荧光结合强度并检测miR-370-3p的表达。结果 抑制LncRNA MALAT-1或过表达miR-370-3p能抑制A549细胞迁移、侵袭,促进细胞凋亡,减少A549细胞活性(P <0.05),并下调p-Akt和p-PI3K蛋白的表达(P <0.05)。与单纯抑制LncRNA MALAT-1比较,抑制LncRNA MALAT-1并干扰miR-370-3p能促进A549细胞迁移、侵袭,抑制细胞凋亡,增加A549细胞活性(P <0.05),并上调p-Akt和p-PI3K蛋白的表达(P <0.05)。TargetScan靶基因预测发现LncRNA MALAT-1与miR-370-3p存在结合位点,荧光素酶报告基因实验验证发现,与MALAT-1WT_1uc+Control组和MALAT-1WT_1uc+miR NC组比较,MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p组相对荧光强度下降(P <0.05),MALAT-1MUT_1uc+miR-370-3p荧光强度无变化(P>0.05),进一步qRT-PCR结果发现,与Control组比较,si-MALAT-1组的miR-370-3p mRNA相对表达量升高(P <0.05),与si-MALAT-1组比较,si-MALAT-1+anti-miR-370-3p组的miR-370-3pmRNA相对表达量降低(P <0.05)。结论LncRNA MALAT-1可以靶向负调控miR-370-3p。抑制LncRNA MALAT-1可以上调miR-370-3p的表达,抑制A549细胞的增殖、迁移及侵袭,促进A549细胞的凋亡,并下调Akt通路蛋白的磷酸化。

LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为

目的:探讨长链非编码RNA MIAT(LncRNA-MIAT)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用与分子机制。方法:用癌症基因组图谱(TCGA)和甲状腺癌(THCA)mRNA-seq数据分析LncRNA-MIAT和组蛋白甲基化转移酶2(EZH2)在甲状腺癌中的表达。用人正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞系FTC-133作为靶细胞。qPCR法检测LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的表达水平差异。RNA荧光原位杂交(FISH)检测LncRNA-MIAT在FTC-133细胞中的定位,Western blot检测EZH2蛋白的表达。荧光素酶报告基因检测LncRNA-MIAT和miR-519d-3p以及miR-519d-3p与EZH2的直接作用。将FTC-133细胞分为6组[空白对照组(control组)、空载体组(Empty vector组)、过表达LncRNA-MIAT组(LncRNA-MIAT组)、miR-519d-3p的抑制剂组(miR-519d-3p inhibitor组)、EZH2的抑制剂EPZ-6438处理组(EPZ-6438组)、miR-519d-3p抑制剂联合过表达LncRNA-MIAT组(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组)]。用Edu试剂盒和平板克隆法检测细胞增殖。用流式细胞术检测细胞凋亡。用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测细胞的行为。结果:LncRNA-MIAT和EZH2在甲状腺癌组织和细胞中的表达均上调,二者具有正相关性(r=0.466,P<0.05),miR-519d-3p在FTC-133细胞中表达下调(P<0.05)。经过双荧光素酶报告基因实验检测发现miR-519d-3p的靶基因是EZH2,且LncRNA-MIAT靶向抑制miR-519d-3p激活EZH2。与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组和miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P<0.05),细胞凋亡率均减少(P<0.05)。EZH2的抑制剂EPZ-6438则减少Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数(P<0.05),增加细胞凋亡率(P<0.05)。分别与LncRNA-MIAT组或miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论:甲状腺癌细胞中LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为。

长链非编码RNA与组蛋白乙酰化关系的研究进展

长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸且不具有编码蛋白质功能的RNA分子,参与基因转录调控,包括染色质修饰和直接的转录调控表达,同时也调控转录后事件。组蛋白乙酰化是表观遗传修饰形式,lncRNAs参与组蛋白乙酰化的调节过程,促进或抑制多种肿瘤的进展。本文就lncRNAs与组蛋白乙酰化关系的研究进展作一综述。

LncRNA GAS5通过TIMP-3启动子甲基化促进软骨胶原蛋白降解的实验研究

目的骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见的关节疾病,可由内源性和表观遗传因素引起。软骨退变可恶化为OA。本研究旨在探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)GAS5在OA中的基本机制。方法14例正常膝关节软骨组织取自2018年7月至2020年7月因胫骨平台骨折在复旦大学附属中山医院吴淞医院行骨折内固定的患者,男8例,女6例;年龄19~40岁,平均(31±5)岁。35例OA膝关节软骨组织取自2018年7月至2020年7月在复旦大学附属中山医院吴淞医院就诊,诊断为OA且有膝关节置换手术指征的患者,男17例,女18例;年龄62~86岁,平均年龄(70±4)岁。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-3 mRNA的表达情况。使用白细胞介素(interleukin,IL)-1β(10 ng/mL)建立OA细胞模型,分析OA基因芯片GSE16464。RT-qPCR和western-blot检测软骨分解代谢抑制因子TIMP-3的表达。用芯片定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测TIMP-3启动子区富集的CpG岛情况。用生物信息学方法预测GAS5与TIMP-3的靶向关系,并用双荧光素酶报告基因检测法进行验证。结果在OA患者组织中TIMP-3 mRNA表达显著低于正常软骨组织,OA患者组与正常软骨组织软骨细胞TIMP-3启动子区甲基化阳性率分别为72.1%和35.7%。LncRNAGAS5在OA中高表达,LncRNAGAS5在OA中表达较正常软骨组织中表达明显上调(P<0.05)。Blast序列比对GAS5序列与TIMP-3启动子序列具有结合位点。沉默LncRNA GAS5促进TIMP-3表达,抑制OA软骨细胞胶原降解。双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与TIMP-3具有靶向调控关系。结论OA软骨组织中TIMP-3低表达,而LncRNA GAS5表达上调;LncRNA GAS5可富集DNA甲基化转移酶,抑制TIMP-3的表达,促进软骨细胞胶原蛋白降解。

血清DNMT1和lncRNA MEG3表达水平与帕金森病的关联性研究

目的探讨血清DNA甲基转移酶1(DNMT1)、长链非编码RNA人类母系表达基因3(lncRNA MEG3)表达水平与帕金森病(PD)的关联性。方法招募2020年3月至2023年1月青海红十字医院神经内科收治的PD患者106例作为PD组,另选择同期健康体检者103名作为对照组。比较两组的临床资料,分析PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3表达水平与临床指标的相关性。采用多因素logistic回归分析影响PD发生的因素,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清DNMT1、lncRNA MEG3水平对PD的诊断价值。结果PD组血清DNMT1水平高于对照组,总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及lncRNA MEG3水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,PD患者血清DNMT1水平与TC、TG、LDL-C水平呈负相关(P<0.05),与统一帕金森病评定量表(UPDRS)Ⅰ评分、UPDRSⅡ评分、UPDRSⅢ评分、Hoehn-Yahr(H-Y)分期呈正相关(P<0.05)。lncRNA MEG3水平与TC、TG、LDL-C水平呈正相关(P<0.05),与UPDRSⅠ评分、UPDRSⅡ评分、UPDRSⅢ评分、H-Y分期呈负相关(P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,较高的血清DNMT1水平是促进PD发生的独立危险因素(P<0.05),较高的lncRNA MEG3水平是抑制PD发生的独立保护因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清DNMT1、lncRNA MEG3水平具有诊断PD的应用价值(P<0.05),且联合两指标可进一步提高诊断效能[AUC(95%CI)=0.906(0.865~0.947)],灵敏度和特异度分别为80.21%和89.34%。结论PD患者血清DNMT1呈高表达,lncRNA MEG3呈低表达,二者联合检测有助于临床诊断PD。

LncRNA FZD10-AS1通过调控miR-337-3p/GPD1分子轴抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移

目的探讨长链非编码RNA(long⁃chain non⁃coding RNA,lncRNA)FZD10⁃AS1通过调控miR⁃337⁃3p上调甘油-3-磷酸脱氢酶1(glycerol⁃3⁃phosphate dehydrogenase 1,GPD1)基因的表达抑制骨肉瘤增殖和迁移的分子机制。方法收集青岛大学附属青岛妇女儿童医院儿童骨科2016年9月至2018年12月47例行骨肉瘤根治术切除的癌组织及相应癌旁组织,qRT⁃PCR检测FZD10⁃AS1在骨肉瘤组织及癌旁组织、骨肉瘤细胞株和正常成骨细胞中的表达量。选择FZD10⁃AS1表达量最低的细胞株为研究对象,Lipofectamine 2000转染试剂分别转染表达FZD10⁃AS1的质粒(观察组)和阴性对照质粒(对照组)至骨肉瘤细胞,CCK⁃8法和细胞划痕实验检测分别FZD10⁃AS1过表达对细胞增殖和迁移能力的影响。生物信息学预测FZD10⁃AS1的作用机制。qRT⁃PCR检测FZD10⁃AS1过表达对下游基因表达的影响,Western Blot检测有关蛋白的表达量。结果骨肉瘤组织中FZD10⁃AS1的表达明显少于癌旁组织(P<0.01)。骨肉瘤细胞株中FZD10⁃AS1的表达明显少于正常成骨细胞(P<0.01),在U⁃2OS细胞中表达量最少(P<0.01)。过表达FZD10⁃AS1明显抑制U⁃2OS细胞的增殖能力和迁移能力(P<0.05)。生物信息学显示,FZD10⁃AS1可互补结合miR⁃337⁃3p,miR⁃337⁃3p可进一步互补结合GPD1 mRNA。过表达FZD10⁃AS1后U⁃2OS细胞中miR⁃337⁃3p表达量明显下降(P<0.01),GPD1 mRNA和蛋白的表达量增加(P<0.01)。结论FZD10⁃AS1在骨肉瘤组织和细胞株中表达明显降低,FZD10⁃AS1通过调控miR⁃337⁃3p促进GPD1基因的表达,从而抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力,FZD10⁃AS1可能成为骨肉瘤治疗及诊断的靶点。

长链非编码RNA AURKAPS1通过上调RAC1活化细胞外信号调节激酶信号通路促进肝癌进展的机制研究

目的探讨AURKAPS1在肝癌细胞中的表达、功能和分子机制,为肝癌的防治提供新思路。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对肝癌细胞系和正常肝脏上皮细胞进行检测;将肝癌细胞系随机分为空白组,AURKAPS1组、RAC1组和AURKAPS1+RAC1组,其中空白组表示肝癌细胞不进行任何干预,AURKAPS1组中的肝癌细胞仅接受AURKAPS1干预,RAC1组为转染RAC1的肝癌细胞,AURKAPS1+RAC1组表示同时转染AURKAPS1和RAC1,采用实时荧光定量PCR技术检测4组细胞中RAC1的表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术和Transwell转移法检测肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移能力;蛋白质免疫印迹法测定各组细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)和RAC1蛋白表达;间接免疫荧光检测细胞中ERK的表达。组间独立样本采用t检验,多组间进行F检验、LSD检验。结果肝癌组织中RAC1 mRNA的表达量(0.98±0.08)显著高于正常人肝上皮细胞组织(0.72±0.03),差异有统计学意义(t=30.431,P<0.05);AURKAPS1组(1.03±0.10)、RAC1组(1.05±0.09)及AURKAPS1+RAC1组(1.16±0.07)的RAC1 mRNA的表达量均高于空白组(1.16±0.07),AURKAPS1+RAC1组的RAC1 mRNA表达量也显著高于分别转染AURKAPS1、RAC1的肝癌细胞组,差异有统计学意义(F=5.991,P<0.05);CCK-8法检测肝癌细胞的增殖,随着时间的增加,除空白组,其余3组的吸光度(A)_(450)值均增加,96 h后AURKAPS1+RAC1组的A_(450)值显著高于RAC1组及AURKAPS1组(F_(0 h)=2.941,F_(24 h)=26.454,F_(48 h)=104.60,F_(72 h)=319.555,F_(96 h)=564.65)P<0.05;AURKAPS1组[(5.89±3.82)%]、RAC1组[(5.81±3.85)%]及AURKAPS1+RAC1组[(4.23±4.15)%]的总凋亡率均低于空白组[(6.75±3.36)%],且AURKAPS1+RAC1组的总凋亡率显著低于RAC1、AURKAPS1组,F=77.369,P<0.05;AURKAPS1组(131.24±9.25)、RAC1组(129.87±9.41)及AURKAPS1+RAC1组(153.62±7.48)的穿膜细胞数均高于空白组(117.64±10.53),且AURKAPS1+RAC1组的穿膜细胞数显著高于RAC1组及AURKAPS1组(F=91.118,P<0.05);Western blot法检测4组肝癌细胞的ERK及RAC1蛋白表达,转染后3组的ERK及RAC1蛋白的相对表达量均高于空白组,且AURKAPS1+RAC1组的ERK及RAC1蛋白的相对表达量显著高于RAC1组及AURKAPS1组(F_(β-actin)=0.000,F_(ERK)=68.342,F_(RAC1)=52.868,P<0.05);AURKAPS1组[10(40.00)]、RAC1组[11(44.00)]及AURKAPS1+RAC1组[19(76.00)]的ERK阳性率均高于空白组[4(16.00)],且AURKAPS1+RAC1组的ERK阳性率显著高于RAC1组及AURKAPS1组(χ^(2)=6.650,P<0.05)。结论长链非编码RNA AURKAPS1能够使RAC1蛋白的表达量增加,活化ERK信号通路,进一步影响肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移,促进肝癌细胞的生长和进展。

低糖缺氧大鼠H9C2细胞中长链非编码RNA NR_027324和miR-103-3p的表达及靶向调节关系验证

目的探索在低糖缺氧的大鼠H9C2心肌细胞中,长链非编码RNA(lncRNA)NR_027324和miR-103-3p的表达变化,以及lncRNA NR_027324对miR-103-3p的靶向调节关系。方法利用逆转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法测定在低糖缺氧H9C2细胞中lncRNA NR_027324和miR-103-3p的表达变化。采用生物信息学的方法,预测H9C2细胞中NR_027324序列上的miR-103-3p结合位点。将NR_027324的3'UTR及点突变序列插入荧光素酶报告载体中,并分别与miR-103-3p类似物(miR-103-3p-mimic)或miR-103-3p类似物阴性对照(mimic-NC),共转染293T细胞。48 h后,通过双荧光素酶检测试剂盒,检测荧光素酶的活性,确定NR_027324与miR-103-3p的靶向关系。通过进一步质粒转染过表达和RNA干扰技术,分别上调和下调H9C2细胞中NR_027324的表达,验证miR-103-3p表达变化。结果低糖缺氧H9C2细胞中,NR_027324表达量明显上调,miR-103-3p表达量下降,ATG5表达量上调。293T细胞中双荧光素酶报告系统结果提示,pmirGLO-NR_027324wt 3'UTR质粒能够与miR-103-3p结合,并抑制双荧光素酶活性,结合位点定点突变后,pmirGLO-NR_027324mut 3'UTR质粒不能与miR-103-3p结合,不能影响双荧光素酶活性的变化。通过质粒转染过表达和RNA干扰技术分别上调和下调H9C2细胞中NR_027324的表达,发现miR-103-3p的表达趋势与之相反,而ATG5表达变化趋势与NR_027324趋向一致。结论低糖缺氧大鼠H9C2细胞中,NR_027324表达量明显上调,miR-103-3p表达量明显下调,miR-103-3p是NR_027324的靶基因。

lncRNA POU3F3通过调节MGMT的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药

目的:探讨lncRNA POU3F3通过调节MGMT的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺(temozolomide,TMZ)耐药及其作用机制。方法:选取2016年1月至2018年1月北京大学国际医院神经外科收治的60例患者组织标本,其中,脑外伤患者12例(正常组)、初发高级别脑胶质瘤患者30例(初发组)、复发高级别脑胶质瘤患者[复发组,已经接受了手术治疗+TMZ综合治疗再次复发的人群]18例。采用1、2、4及8μg/ml TMZ诱导U251细胞并维持正常生长1周以构建抵抗U251 TMZ耐药细胞系(U251 TMZ-resistance,U251-TR);正常组采用相同体积的0.9%生理盐水处理U251细胞。采用qPCR和Wb检测正常脑组织及神经胶质瘤细胞中POU3F3和甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)mRNA和蛋白的表达水平。慢病毒转染构建稳定干扰POU3F3的U251-TR细胞系(U251-TR stable interference POU3F3,U251-TR siPOU3F3),MTT法验证U251-TR细胞并检测细胞TMZ IC50值,Wb检测细胞中MGMT蛋白的表达水平。结果:与正常组及初发组比较,复发组POU3F3表达显著增高(P<0.01),U251-TR细胞TMZ IC50值显著高于U251细胞(P<0.01),U251-TR siPOU3F3细胞TMZIC_50值显著低于U251-TR细胞(均P<0.01),但高于U251细胞(P<0.01);U251-TR细胞POU3F3及MGMT mRNA和蛋白的表达水平均高于U251细胞(均P<0.01),U251-TR siPOU3F3细胞POU3F3及MGMT mRNA和蛋白表达水平均低于U251-TR细胞(均P<0.01)。结论:lncRNA POU3F3是促进高级别脑胶质瘤细胞TMZ耐药性的关键因素,可能对临床上TMZ耐药的研究有一定的意义。

LncRNA SNHG25在直肠癌细胞中的表达及其调节miR-330-3p/SMYD3轴对直肠癌细胞迁移及侵袭的影响

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因25(SNHG25)对直肠癌(RC)细胞迁移、侵袭的影响及微小RNA(miR)-330-3p/组蛋白甲基化转移酶3(SMYD3)轴在此过程中所发挥的作用。方法使用Real-Time PCR检测SNHG25在不同细胞系的表达及其沉默效率,Transwell实验检测下调SNHG25对RC细胞迁移和侵袭的影响。再次培养细胞,并依实验目的分为NC组(不作任何处理)、miR-330-3p mimics组(转染miR-330-3p模拟物)、miR-330-3p inhibitor组(转染miR-330-3p抑制物)、sh-SNHG25-1+miR-330-3p inhibitor组(转染sh-SNHG25-1+miR-330-3p抑制物)、SMYD3组(转染pcDNA-SMYD3)、si-SMYD3(转染si-SMYD3)、SMYD3+miR-330-3p mimics(转染pcDNA-SMYD3+miR-330-3p模拟物),Real-Time PCR检测各组细胞中miR-330-3p与SMYD3 mRNA表达;Transwell实验检测各组RC细胞迁移、侵袭能力。结果与人正常肠黏膜上皮细胞系(FHC)细胞比较,RC细胞(SW837、SW1463及HR8348)中SNHG25的表达增高,且在HR8348细胞中表达明显高于其他RC细胞系(3.12±0.17、1.96±0.15、4.87±0.22比1.00±0.03,P<0.05),选择HR8348细胞进行后续实验。与sh-NC比较,sh-SNHG25-1/2/3组细胞中SNHG25表达均被下调,且sh-SNHG25-1下调效率最高(1.02±0.01比0.21±0.02、0.52±0.03、0.36±0.04,P<0.05);sh-SNHG25-1组细胞中RC细胞迁移数量和侵袭数量均减少(205.13±21.23比120.34±11.98和89.92±8.15比30.27±3.59,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,SNHG25与miR-330-3p、miR-330-3p与SMYD3均存在负向调控关系。与NC组比较,miR-330-3p mimics组细胞中miR-330-3p表达增加(1.03±0.01比1.67±0.15,P<0.05),迁移细胞数量和侵袭细胞数量减少(210.08±12.96比131.36±10.45和77.45±8.69比21.74±2.04,P<0.05);miR-330-3p inhibitor组细胞中miR-330-3p表达降低(1.03±0.01比0.43±0.05,P<0.05),迁移细胞数量和侵袭细胞数量增多(210.08±12.96比246.95±16.34和77.45±8.69比122.03±9.51,P<0.05);与miR-330-3p inhibitor比较,sh-SNHG25-1+miR-330-3p inhibitor组细胞中miR-330-3p表达增高(0.43±0.05比0.76±0.04,P<0.05),细胞侵袭和迁移数量减少(246.95±16.34比167.54±11.79和122.03±9.51比52.88±5.07,P<0.05)。与NC组相比,SMYD3组细胞中SMYD3 mRNA表达增高(1.02±0.03比2.34±0.19,P<0.05),细胞的迁移和侵袭数量增多(215.26±15.38比351.04±20.96和86.33±9.65比129.87±11.52,P<0.05);si-SMYD3组细胞中SMYD3 mRNA表达降低(1.02±0.03比0.31±0.04,P<0.05),细胞的迁移和侵袭数量减少(215.26±15.38比128.54±15.47和86.33±9.65比28.92±4.91,P<0.05)。与SMYD3组相比,SMYD3+miR-330-3p mimics组细胞中SMYD3 mRNA表达降低(2.34±0.19比0.72±0.07,P<0.05),细胞的迁移和侵袭数量减少(351.04±20.96比168.08±13.44和129.87±11.52比63.01±5.18,P<0.05)。结论下调SNHG25表达可能通过调控miR-330-3p/SMYD3轴抑制RC细胞侵袭及迁移。

血清lncRNA UBE2CP3在肝细胞癌筛查中的应用价值

目的检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清中lncRNA泛素结合酶E2C(VBE2C)假基因3 (UBE2CP3)的表达水平,并分析其临床应用价值。方法收集79例健康人对照者、92例HCC患者以及23例HCC合并肝内外转移HCC患者的血清标本,另收集18例接受HCC根治术的患者术前及术后30 d的血清标本;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组血清中UBE2CP3的表达水平。结果血清UBE2CP3在健康人对照组(12.90±4.96)、HCC未转移组(17.39±3.11)、HCC转移组(22.54±3.96)中的表达水平差异具有统计学意义(F=59.23,P<0.01);UBE2CP3筛查HCC的ROC曲线面积(AUCROC)为0.794,95%CI为0.728~0.859,当cut-off值为14.035时,其敏感性为56.96%,特异性为90.35%;术后30 d HCC患者血清UBE2CP3的表达水平显著低于术前水平,差异具有统计学意义(t=3.934,P<0.01)。结论血清lncRNA UBE2CP3对HCC的诊断、预后及疗效判断具有一定的价值。

BPD新生大鼠长链非编码RNA H19表达及其作用的研究

目的研究支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)新生大鼠肺组织长链非编码RNA H19(long non-coding RNA H19,LncRNA H19)表达及其对组蛋白甲基化转移酶2,即zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)调节作用,为阐明BPD肺上皮细胞-间质转化(epithelium-interstitial transformation,EMT)的病理机制奠定基础。方法采用高浓度氧(吸入氧浓度为85%)诱导SD新生大鼠BPD模型(n=50),对照组吸入氧浓度为21%(n=50),两组分别于生后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d采集肺组织,应用免疫组织化学、Western blot、荧光实时定量PCR等技术,观察EZH2蛋白的表达定位,检测EZH2蛋白表达水平及H19和EZH2的mRNA表达水平。结果免疫组织化学可见EZH2蛋白在肺泡上皮细胞的细胞核与细胞浆中均有明显定位,模型组较对照组表达明显增强。同样Western blot结果显示,与对照组比较,模型组EZH2蛋白表达从1d开始增高(对照组0.196±0.030,模型组0.650±0.149,P<0.05),趋势持续到21 d(对照组0.934±0.215,模型组1.785±0.298,P<0.05)。BPD模型组H19的mRNA表达水平从7 d开始较对照组增加(对照组2.591±0.211,模型组3.558±0.093,P<0.05),EZH2 mRNA表达水平从3 d开始较对照组增加(对照组1.246±0.015,模型组2.148±0.215,P<0.05),且基因水平随高氧暴露时间延长两组差异愈发明显。结论在BPD的发生、发展中,肺组织H19与EZH2基因与蛋白水平表达均上调,且H19表达高峰先于EZH2,提示H19可能参与了EZH2介导的EMT引发肺发育不良的发生过程。

乳腺癌组织lncRNA TUG1、EZH2表达变化及其临床意义

目的探讨乳腺癌组织长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)、组蛋白甲基化转移酶2(EZH2)表达变化及其临床意义。方法选择原发性乳腺癌患者83例,取手术切除的乳腺癌组织及其配对的癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测lncRNA TUG1、EZH2相对表达量。比较乳腺癌组织与癌旁正常组织lncRNA TUG1、EZH2表达,分析乳腺癌组织lncRNA TUG1表达与EZH2表达的关系,以及乳腺癌组织lncRNA TUG1、EZH2表达与患者临床病理特征和预后的关系。结果乳腺癌组织lncRNA TUG1、EZH2相对表达量均高于癌旁正常组织(P均<0.01)。Pearson相关分析显示,乳腺癌组织lncRNA TUG1相对表达量与EZH2相对表达量呈正相关关系(P<0.01)。乳腺癌组织lncRNA TUG1相对表达量与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05),与患者年龄、乳腺癌家族史、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05);乳腺癌组织EZH2相对表达量与肿瘤组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05),与患者年龄、乳腺癌家族史、肿瘤直径、TNM分期无关(P均>0.05)。以乳腺癌组织lncRNA TUG1、EZH2相对表达量的中位数为临界值,将患者分为lncRNA TUG1高表达者46例与lncRNA TUG1低表达者37例、EZH2高表达者43例与EZH2低表达者40例。lncRNA TUG1、EZH2高表达者3年生存率均低于其相应低表达者(P均<0.05)。结论乳腺癌组织lncRNA TUG1、EZH2表达升高,且二者表达呈正相关关系;lncRNA TUG1、EZH2表达升高与乳腺癌恶性进展和患者预后不良有关。

3-O-C12-HSL通过PPARγ拮抗树突状细胞表达RP11-367F23.2

目的 研究N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C 12 -HSL)是否抑制单核细胞来源树突状细胞(Mo-DCs)表达RP11-367F23.2,该抑制作用是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)介导。方法 采用密度梯度离心法分离单核细胞来源的Mo-DCs;将Mo-DCs细胞分为4组:脂多糖(LPS)组、3-O-C 12 -HSL组、GW9662组和PBS组,18 h后收集细胞;荧光定量PCR检测4组中RP11-367F23.2表达情况。结果 Mo- DCs经3-O-C 12 -HSL刺激后,RP11-367F23.2表达量降低,3-O-C 12 -HSL组和LPS组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05);Mo-DCs经GW9662处理后,细胞中的RP11-367F23.2表达量升高,3-O-C 12 -HSL组和GW9662组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05)。结论 3-O-C 12 -HSL通过PPARγ拮抗Mo-DCs表达RP11-367F23.2。