长链非编码RNA RP11-497E19.1对胃癌细胞增殖和侵袭的影响及机制实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-497E19.1对胃癌细胞增殖和侵袭的影响及其机制。方法:实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测胃癌HS-746T、BGC823、NCI-N87、SGC7901、AGS细胞和永生化胃上皮细胞GES-1中RP11-497E19.1表达水平,筛选表达最高的细胞进行后续实验。将HS-746T细胞分为si-NC组和si-RP11-497E19.1组,分别转染阴性对照寡核苷酸或RP11-497E19.1小干扰RNA。集落形成实验和Transwell实验分析转染HS-746T细胞的增殖、侵袭能力。双荧光素酶报告基因实验验证RP11-497E19.1与微小RNA(miR)-545-5p的靶向关系。RT-qPCR检测转染HS-746T细胞miR-545-5p的表达。Western blot检测转染HS-746T细胞间质表皮转化因子(c-Met)/胆绿素还原酶(BVR)/活化复制因子2(ATF-2)分子通路相关蛋白的表达。结果:与GES-1细胞比较,HS-746T、BGC823、NCI-N87、SGC7901、AGS细胞中RP11-497E19.1表达水平均上升,且HS-746T细胞RP11-497E19.1表达水平最高(均P<0.05)。与si-NC组比较,si-RP11-497E19.1组HS-746T细胞活力和细胞侵袭数降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实RP11-497E19.1靶向结合miR-545-5p,可负向调控miR-545-5p表达(P<0.05)。与si-NC组比较,si-RP11-497E19.1组HS-746T细胞c-Met/BVR/ATF-2分子通路蛋白c-Met、BVR、p-ATF-2、锌指蛋白1(Snail1)、锌指蛋白2(Snail2)表达降低(均P<0.05)。结论:胃癌细胞中RP11-497E19.1呈高表达,沉默RP11-497E19.1通过靶向miR-545-5p/c-Met/BVR/ATF-2分子通路抑制胃癌HS-746T细胞的增殖及侵袭。

长链非编码RNA RP11-572P18.1对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及作用机制实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-572P18.1对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。方法:采用国际癌症基因组联盟(ICGC)数据库分析卵巢癌组织中RP11-572P18.1表达水平。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测卵巢癌细胞系OC3、A2780、Caov-3、SK-OV-3、HO-8910中RP11-572P18.1表达水平,选取表达水平最低的细胞进行后续实验。将Caov-3细胞分为RP11-572P18.1组和NC组,分别转染RP11-572P18.1过表达质粒和对照质粒。MTT实验检测Caov-3细胞增殖能力,Transwell实验检测Caov-3细胞侵袭能力。双荧光素酶报告基因实验验证RP11-572P18.1和miR-205-5p的靶向关系。采用RT-qPCR检测Caov-3细胞miR-205-5p表达。采用免疫印迹法(Western blot)检测Caov-3细胞增殖蛋白[细胞周期蛋白B(Cyclin B)、细胞周期蛋白E(Cyclin E)]和侵袭蛋白[锌指E盒同源结合蛋白1(Zeb1)、转录因子(Twist)、β-连环蛋白(β-catenin)]表达。结果:与正常组织比较,卵巢癌组织中RP11-572P18.1表达降低(P<0.01)。与正常卵巢上皮细胞IOSE80比较,卵巢癌细胞系中RP11-572P18.1表达水平降低,且Caov-3细胞降低最显著(均P<0.05)。与NC组比较,RP11-572P18.1组Caov-3细胞增殖能力及侵袭数目降低(均P<0.05)。RP11-572P18.1与miR-205-5p存在靶向关系。与NC组比较,上调RP11-572P18.1可抑制Caov-3细胞miR-205-5p以及Cyclin B、Cyclin E、Zeb1、Twist和β-catenin蛋白表达(均P<0.05)。结论:RP11-572P18.1在卵巢癌组织和细胞系中表达降低,RP11-572P18.1通过下调miR-205-5p抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭。

LncRNA RP11-259P1.1在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨长链非编码RNA RP11-259P1.1(lncRNA RP11-259P1.1)在小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)患者组织中的表达与患者临床病理特征的关系及其在化疗耐药中的作用。方法:收集2012年1月至2016年12月在成都市第六人民医院和成都军区总医院158例行支气管镜活检、穿刺活检和手术切除的SCLC患者的癌组织、42例SCLC患者手术切除的癌旁组织标本及40例正常肺组织,采用qPCR法检测癌及癌旁组织标本中lncRNA RP11-259P1.1的表达,χ2检验分析lncRNA RP11-259P1.1表达与SCLC患者临床病理特征及化疗耐药的关系。单因素及多因素Cox回归分析lncRNA RP11-259P1.1表达与SCLC患者预后的关系。结果:lncRNA RP11-259P1.1在SCLC组织中的表达水平显著高于癌旁组织及正常肺组织(均P<0.01)。化疗敏感者癌组织中lncRNA RP11-259P1.1的表达水平明显低于化疗耐药者(P<0.05)。lncRNA RP11-259P1.1表达与SCLC患者的性别、年龄无关,与肿瘤分期、转移及化疗敏感性显著相关(均P<0.05);高表达lncRNA RP11-259P1.1患者的PFS及OS均显著短于低表达患者[(12.25±1.83)vs(22.29±1.58)个月和(23.55±1.35)vs(31.75±2.43)个月,均P<0.01]。lncRNA RP11-259P1.1表达、肿瘤分期及远处转移是SCLC患者独立的预后因素(均P<0.05)。结论:lncRNA RP11-259P1.1在SCLC组织中高表达,与SCLC患者的化疗敏感性及预后相关,可能是SCLC患者潜在的预后评估的生物标志物。

lncRNA RP11-259P1.1在食管鳞状细胞癌中的表达及其与临床预后的关系

目的:探讨lnc RNA RP11-259P1.1在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)中的表达水平及其与患者临床病理特征和预后的关系。方法:收集2012年1月1日至2016年12月31日西南医科大学附属医院行手术切除的130例ESCC原发病灶及对应癌旁组织标本、人ESCC细胞株KYSE510、Eca109及食管上皮细胞株Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测lnc RNA RP11-259P1.1在ESCC组织及细胞中的表达水平,分析其在组织中表达水平与患者临床病理特征及预后的关系。结果:lnc RNA RP11-259P1.1在ESCC细胞及组织中表达水平显著高于正常管上皮细胞及癌旁组织(均P<0.01)。lnc RNA RP11-259P1.1高表达与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移及术前放化疗(CRT)后肿瘤缓解明显相关(均P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤部位、吸烟状况等无关(均P>0.05)。在63例术前接受新辅助CRT治疗患者中,低表达lnc RNA RP11-259P1.1患者与高表达患者比较:(1)病理完全缓解率明显升高(60.00%vs 21.21%,P<0.01);(2)术前CRT的疗效更佳(P<0.05);(3)中位无进展生存时间和生存时间均明显延长[(28.00±2.47)vs(17.00±1.90)个月,(41.57±2.45)vs(30.00±2.55)个月;均P<0.01]。lnc RNA RP11-259P1.1为ESCC患者独立的预后因素(P<0.05)。结论:lnc RNA RP11-259P1.1可能是ESCC潜在的预后和术前CRT疗效评价的分子标志物,低表达lnc RNA RP11-259P1.1的患者术前给予CRT疗效更佳。

RP11-366L20.3通过NF-κB通路调控E-cadherin表达

目的研究长链非编码RNA RP11-366L20.3在调控炎症因子表达中的作用。方法运用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激THP-1细胞6 h,然后收集细胞提取RNA并通过RT-qPCR筛选上调表达的长链非编码RNA,RACE(c DNA末端快速扩增)获取其基因全长,Northern blot验证基因的真实长度和LPS刺激效果,细胞通路抑制剂分析其转录调控通路和胞内分布,过表达和siRNA处理细胞分析RP11-366L20.3调控的下游炎症因子及机理。结果筛选出一个长链非编码RNA RP11-366L20.3,LPS刺激能上调该基因的表达,RACE扩增全长为833 bp,Northern blot也验证了RACE的实验结果,RP11-366L20.3主要分布于细胞核,其基因的转录受到NF-κB信号通路调控;同时RP11-366L20.3是一个TLR4通路的非编码RNA,过表达RP11-366L20.3能降低E-cadherin的基因表达,而siRNA敲低RP11-366L20.3则能上调E-cadherin的基因表达,RIP实验表明RP11-366L20.3能与P50蛋白直接结合,LPS刺激能增强RP11-366L20.3与p50的结合,从而抑制E-cadherin的基因表达。结论长链非编码RNA RP11-366L20.3通过NF-κB通路因子P50调控E-cadherin的基因表达。

lncRNA RP11-635L1.2在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨在膀胱癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)RP11-635L1.2的表达变化及对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响。方法通过GEPIA数据库分析膀胱癌组织中RP11-635L1.2的表达变化。行qRT-PCR检测RP11-635L1.2在膀胱癌细胞系MGH-U3、253J、J82、T24中的相对表达量。选择RP11-635L1.2表达最低的膀胱癌细胞(J82细胞),分为NC组和RP11-635L1.2组,分别转染空载质粒和RP11-635L1.2过表达质粒。qRT-PCR检测验证转染效率。采用CCK-8法和Transwell实验分别观察RP11-635L1.2对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响。利用LncCeRBase数据库预测RP11-635L1.2靶基因,采用双荧光素酶报告实验验证RP11-635L1.2和miR-373-3p的靶向性。qRT-PCR检测2组细胞中miR-373-3p的相对表达量。行Western blot实验检测2组细胞中EGFR/AKT信号通路蛋白的表达情况。结果RP11-635L1.2在膀胱癌组织中表达水平明显低于癌旁正常组织(P<0.01)。RP11-635L1.2在膀胱癌细胞系MGH-U3、253J、J82、T24中的表达水平明显低于在永生化膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达水平(P<0.05,P<0.01),且在J82细胞中的表达水平最低。相比NC组,上调RP11-635L1.2后,J82细胞增殖能力及侵袭能力显著下降(P<0.05,P<0.01)。RP11-635L1.2和miR-373-3p具有靶向性(P<0.01)。相比NC组,RP11-635L1.2组miR-373-3p表达被明显抑制(P<0.01),EGFR/AKT信号通路蛋白p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3表达量明显下降(P<0.01)。结论RP11-635L1.2在膀胱癌组织和细胞系中呈现低表达,上调RP11-635L1.2通过与miR-373-3p结合抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭,其可能成为膀胱癌新的诊断标志物和治疗靶点。

RP11-273G15.2靶向微小RNA-9-5p对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA RP11-273G15.2靶向调控微小RNA-9-5p(miR-9-5p)表达及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用GEPIA分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中269例肝癌组织和50例正常组织的RP11-273G15.2水平;实时定量PCR(qPCR)检测正常人肝细胞HL-7702和肝癌细胞(SMMC-7721、HepG2和BEL-7404)的RP11-273G15.2水平,构建过表达RP11-273G15.2的pcDNA3.1质粒并采用脂质体转染SMMC-7721细胞(过表达组),同时设未行转染的细胞为空白对照组和转染空载pcDNA3.1质粒的阴性对照组。采用qPCR、噻唑蓝(MTT)比色法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测RP11-273G15.2水平、细胞活力和凋亡率,qPCR和Western blotting检测凋亡相关因子的表达情况,利用LncBase Predicted v.2在线预测RP11-273G15.2可能结合的下游miRNAs并筛选miR-9-5p为研究目标,构建pGL3荧光素酶报告载体并采用双荧光素酶报告分析系统验证RP11-273G15.2对miR-9-5p的结合能力。结果GEPIA分析结果显示,269例肝癌组织的RP11-273G15.2水平低于50例正常组织(P<0.05)。肝癌细胞的RP11-273G15.2水平均低于HL-7702细胞(P<0.05),选取RP11-273G15.2水平最低的SMMC-7721细胞进行后续过表达实验;与其余两组相比,过表达组的RP11-273G15.2水平升高而miR-9-5p水平降低且转染48~72 h的细胞活力减弱(P<0.05)。过表达组的凋亡率为(26.173±3.065)%,均高于空白对照组的(11.567±2.135)%和阴性对照组的(10.136±1.740)%(P<0.05)。与其余两组相比,过表达组的Bcl-2水平降低,而Bax、caspase-3和cleaved caspase-3水平升高(P<0.05)。MiR-9-5p模拟物能抑制转染野生型pGL3质粒的荧光素酶活性(P<0.05),但对突变型质粒无影响(P>0.05)。结论肝癌组织和细胞中RP11-273G15.2低表达且发挥抑癌作用,上调其水平可抑制增殖并诱导凋亡,可能与靶向miR-9-5p有关,RP11-273G15.2/miR-9-5p轴在肝癌治疗中有一定潜能。

长链非编码RNA RP11-486P11.1调控结肠癌转移相关基因1在肺腺癌侵袭转移中的作用

目的观察长链非编码RNA(lncRNA) RP11-486P11.1对结肠癌转移相关基因1(MACC1)调控及在肺腺癌侵袭转移中的作用。方法收集180例肺腺癌患者手术切除肺组织样本,从中各选取3份进行lncRNA表达谱芯片测定,筛选肺腺癌中表达有明显差异的lncRNA。实时荧光定量聚合酶链反应测定肺腺癌患者肺癌组织和癌旁组织、肺癌细胞株H1229、A549、NL9980和人支气管上皮样细胞HBE中非编码RNA RP11-486P11.1的相对表达量。RP11-486P11.1慢病毒表达质粒转染A549细胞;Transwell小室检测细胞侵袭性,划痕试验检测细胞迁移性。结果基因芯片结果显示腺癌中有45条lncRNA呈现不同程度的高表达,31条呈现低表达,RP11-486P11.1在芯片结果中差异有统计学意义(P<0.05),且在肿瘤中各组内表达水平均低于正常组织。lncRNA RP11-486P11.1在肺腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.05);在肺癌细胞株H1229、A549及NL9980中的表达明显低于HBE。RP11- 486P11.1慢病毒表达质粒转染可增加A549中RP11-486P11.1的表达水平;Transwell小室结果显示质粒转染组的穿膜细胞数为16.6±2.15,比慢病毒空载体组(37.7±2.4)和正常对照组(39.2±3.5)的平均穿膜细胞数量低。划痕试验结果显示,正常对照组和质粒转染组各自的距离分别为(896±23)、(294±18)μm,RP11-486P11.1组的间距明显小于对照组(P<0.01)。结论肺腺癌细胞和组织中低表达的lncRNA RP11-486P11.1在肺腺癌的侵袭和迁移过程中发挥重要作用。