siRNA抑制肝癌细胞DNA修复门控基因表达的实验

目的本实验旨在研究siRNA抑制DNA修复门控基因Rad52、Ku70和Ku80的效果并筛选出高效的siRNA作用靶位。方法依据siRNA设计原则,针对每一个门控基因的mRNA序列各选择了2个靶位点并构建了相应的siRNA表达载体(psiRNA1～6)。酶切分析及DNA测序鉴定重组质粒构建成功后,将其转染人肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Western Blot分别用来检测psiRNAs在转录水平和翻译水平干扰靶基因的效果。结果psiRNA1～6作用细胞后明显抑制了靶基因的表达。比较而言,psiRNA1、psiRNA4、psiRNA5干扰效果分别比psiRNA2、psiRNA3、psiRNA6更佳。结论siRNA为进一步研究DNA修复门控基因Rad52、Ku70和Ku80的功能奠定基础。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因与心脏节律发生、发展及预后的关系

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因在心脏节律的发生、发展及预后中有着重要的作用。研究表明,HCN4基因为窦房结起搏细胞产生自动节律的基础,也可影响心脏传导系统功能发育,其突变与病窦综合征有着密切的关系。通过HCN4起搏通道基因的转染技术构建生物心脏起搏器具有重要的生理意义。

由SCN4A基因错义突变导致的严重新生儿发作性喉痉挛1例及文献复习

严重新生儿发作性喉痉挛(severe neonatal episodic laryngospasm,SNEL)是一种离子通道病,该病因钠电压门控通道4亚基(sodium voltage-gated channel alpha subunit 4 gene,SCN4A)基因突变导致反复发作性咽喉肌强直而危及新生儿生命。现报告1例在出生后出现阵发性发绀和四肢强直的新生儿病例,随访期间,患儿还出现四肢肌肥大和生长发育迟缓。全外显子测序证实该患儿存在SCN4A基因新型杂合突变(c.2395G>A,p.Ala799Thr)。卡马西平是治疗该病的有效药物。此病例扩展了我们对SCN4A基因突变表型的认识。总结已报道的16例SNEL病例特点,发现他们主要发生p.G1306E位点错义突变。相似症状表现为新生儿期上气道肌紧张和喂养困难,长大后多数患者表现为不同程度的发作性肌强直和进行性的肌肥大。一些患者出现"运动员"特征外貌,但几乎所有患者肌电图均有肌强直放电。

妊娠期高血压患者钙电压门控通道亚单位α1c基因与疾病易感性的关系

目的探究妊娠期高血压患者钙电压门控通道亚单位α1c基因(CACNA1C)多态性与疾病易感性的关系。方法选取2020年1月到2022年6月于海口市妇幼保健院建档的375例妊娠期高血压孕妇和303名正常孕妇,分别作为妊娠期高血压组和对照组,收集两组孕妇孕晚期生化指标检测结果,采用聚合酶链反应-限制性酶切片断长度多态性(PCR-RFLP)法检测两组孕妇CACNA1C基因rs2238032、rs10848683、rs2299661位点等位基因,多因素logistic回归分析CACNA1C基因与妊娠期高血压发生的关系。结果两组CACNA1C rs2238032位点基因型构成比差异具有统计学意义(P<0.05),而rs10848683及rs2299661位点基因型构成比差异无统计学意义(P>0.05)。对照组中rs2238032位点不同基因型患者年龄、体重指数、孕周、孕次、24 h平均收缩压、24 h平均舒张压差异无统计学意义(P>0.05)。妊娠期高血压组中rs2238032位点TT型患者体重指数、24 h平均收缩压、24 h平均舒张压高于GT型、GG型患者(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,rs2238032基因型多态性是影响妊娠期高血压发生的相关因素(P<0.05)。结论妊娠期高血压患者CACNA1C基因rs2238032位点TT型突变与血压水平变化有关,且会增加妊娠期高血压易感性。

肥厚型心肌病患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道mRNA的表达

目的探讨肥厚型心肌病患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)的表达。方法构建重组质粒,用梯度稀释的质粒模板建立SYBRGreen荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测HCN4的标准曲线,利用建立的RT-PCR体系对肥厚型心肌病和正常心肌组织标本的左室HCN4mRNA进行检测。结果成功构建了质粒重组子,并建立用SYBRGreen荧光染料在RNA水平检测HCN4通道的标准曲线。HCN4通道在肥厚型心肌病中的表达水平高于正常心肌。结论肥厚型心肌病患者HCN4mRNA的表达较正常人增高。

大白菜BrCNGC全基因组鉴定及其表达分析

[目的]本文旨在研究大白菜环核苷酸门控离子通道基因(BrCNGC)的进化关系、结构特征、染色体定位及其表达模式。[方法]通过生物信息技术对大白菜BrCNGC进行分子进化分析、功能结构分析、染色体定位分析、保守结构域分析,并且通过荧光定量PCR分析该基因家族在脱落酸(ABA)+芜菁花叶病毒(TuMV)、水杨酸(SA)+TuMV、茉莉酸甲酯(MeJA)+TuMV和抗坏血酸(AsA)+TuMV处理下的表达差异。[结果]大白菜BrCNGC家族有26个成员,可分为4个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),其中第Ⅳ组又可以分为2个亚组(Ⅳa和Ⅳb)。它们分布在9条染色体上,1号染色体上BrCNGC数量最多(有5个),5号染色体上只有1个BrCNGC基因,而8号染色体上没有BrCNGC基因分布。基因结构分析表明:该家族基因中共鉴定出10种motif,其中有14个BrCNGC蛋白都包含这10种motif,同组成员之间的motif组成相似。荧光定量PCR结果表明:在植物生长调节剂与TuMV相互作用下,大部分BrCNGC的表达量上调,少数BrCNGC的表达量下调。[结论]大白菜BrCNGC结构高度保守,其在大白菜抵御TuMV侵染过程中发挥一定的作用,该发现为以后进一步研究BrCNGC的功能奠定了基础。

Dravet综合征SCN1A基因新突变及遗传咨询

目的 对2例癫痫伴精神运动发育迟缓的患儿进行遗传学病因分析,旨在为患儿治疗及其家庭遗传咨询、生育指导提供依据。方法 提取2例患儿及其父母外周血基因组DNA并采用全外显子测序技术进行检测,按照美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG,2015)标准进行致病性分析,通过Sanger测序验证致病变异。结果 全外显子测序结果发现,2例患儿电压门控性钠离子通道α1亚单位基因(SCN1A)基因存在c.5354T>C(p.I1785T)和c.4380T>A(p.Y1460*)新发de novo杂合突变,分别评估变异为可疑致病、致病突变位点,Sanger测序验证了该突变并确认双方父母相应位点均为野生型。结论 结合临床和基因诊断信息,2例患儿均被诊断为常染色体显性遗传病Dravet综合征,明确患儿的致病原因对于合理治疗方案的制定及其家庭的优生优育、遗传咨询具有重要的意义。

湖北省武汉市居民区白纹伊蚊电压门控钠离子通道基因突变分析

目的了解武汉市居民区生境白纹伊蚊种群电压门控钠离子通道(VGSC)基因突变情况,初步探索该市白纹伊蚊抗药性机制。方法2021年8-10月在武汉市居民区生境采集白纹伊蚊幼虫和蛹,于实验室饲养至成蚊,抽提单只成蚊的基因组DNA,PCR扩增VGSC基因部分片段,测序后分析VGSC基因型分布情况,并采用χ^(2)检验对雌雄蚊在VGSC基因各突变位点基因型分布进行比较分析。结果共检测武汉市居民区生境的白纹伊蚊238只,其中雌蚊126只,雄蚊112只。武汉市白纹伊蚊种群在VGSC基因V1016、I1532与F1534位点存在突变。V1016位点有2种等位基因,分别为野生型GTA/V(43.91%)和突变型GGA/G(56.09%);3种基因型分别为野生型纯合子V/V(19.33%)、野生/突变型杂合子V/G(49.16%)和突变型纯合子G/G(31.51%)。I1532位点有2种等位基因,分别为野生型ATC/I(99.16%)和突变型ACC/T(0.84%);2种基因型分别为野生型纯合子I/I(98.32%)和野生/突变型杂合子I/T(1.68%)。F1534位点发现3种等位基因,分别为野生型TTC/F(60.72%)、突变型TCC/S(33.19%)、TGC/C(6.09%);5种基因型分别为野生型纯合子F/F(35.30%)、野生/突变型杂合子F/S(41.60%)和F/C(9.24%)、突变型纯合子S/S(10.92%)与突变型杂合子S/C(2.94%)。VGSC基因D1763位点未检测到突变,仅存在野生型GAC/D(100%)等位基因。不同性别白纹伊蚊个体间VGSC基因V1016、I1532与F1534位点的基因型分布差异均无统计学意义(χ^(2)=0.198,P=0.656;χ^(2)=0.014,P=0.905;χ^(2)=2.210,P=0.137)。结论武汉市白纹伊蚊VGSC基因突变频率较高,可能是该市白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性迅速发展的重要机制之一。雌、雄蚊VGSC基因突变无明显差异。

心脏瓣膜病心房颤动患者心房肌超极化激活环化核苷酸门控通道基因表达的研究

目的研究心脏瓣膜病心房颤动（房颤）患者心房肌超极化激活环化核苷酸门控通道（HCN）各亚型及其调控因子环腺苷酸（cAMP）的基因转录，探讨房颤患者心房肌超极化激活电流（If）改变的分子机制。方法心外科心脏瓣膜病需开胸换瓣的病人45例，分为两组，其中房颤者27例，窦性心律者18例，术中取左心房组织，采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定HCN1、HCN2、HCN4、cAMP的mRNA的含量。结果同窦性心律组相比，房颤组患者心房肌HCN2、14CN4的mRNA表达水平上调（P〈0．05），HCN1、cAMP的mRNA表达水平在房颤组患者中亦有增高，但差异无统计学意义（P〉0．05）。HCN2的mRNA表达与左心房内径呈正相关（r=0．441，P=0．002）。结论心房肌HCN2、HCN4的mRNA表达水平上调可能是心脏瓣膜病房颤患者心房肌If电流改变的重要分子基础，通过If的改变进一步参与心房的电重构。

心脏电子起搏器时代与生物起搏替代的前沿话题(英文)

学术背景:植入电子起搏器是目前治疗症状性缓慢心律失常的主要方法,然而它存在许多缺点。能否利用分子生物学原理发展生物起搏器成为大家关注的热点。通过转染编码If电流的超极化激活环核苷酸门控通道基因,过度表达超极化激活环核苷酸门控通道,增加心脏舒张期内向电流,从而在窦房结被抑制时提供起搏作用,这种利用基因治疗和细胞治疗构建的生物起搏在不久的将来可能会成为电子起搏器最为理想的替代方法。目的:总结超极化激活环核苷酸门控通道基因构建生物起搏的研究进展。检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1979-01/2007-06的相关文献,检索词"hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel;biological pacemaker",并限定文章语言种类为English。共检索到157篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与生物起搏及超极化激活环核苷酸门控通道基因密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准:重复性研究。文献评价:文献的来源主要是超极化激活环核苷酸门控通道基因的基础实验。所选用的36篇文献中,10篇为综述,其余均为临床或基础实验研究。资料综合:①在4种异构体中超极化激活环核苷酸门控通道1,2,4是心脏中的主要部分,超极化激活环核苷酸门控通道3只在胚胎起搏细胞中有低水平表达。起搏活性小的区域(如心室肌),超极化激活环核苷酸门控通道2的表达占优势;而起搏活性高的区域超极化激活环核苷酸门控通道4的表达占优势。此外,超极化激活环核苷酸门控通道2在整个发育阶段,是心室的主要异构体,超极化激活环核苷酸门控通道2:超极化激活环核苷酸门控通道4的相当表达量在乳鼠为5:1,成年鼠为13:1。②超极化激活环核苷酸门控通道通道缺陷可导致病窦综合征。③到目前为止,转染编码If电流的超极化激活环核苷酸门控通道基因被认为是最有可能实现生物起搏的。结论:基因治疗和细胞治疗必将成为改善生物"起搏"功能最理想的方法,以超极化激活环核苷酸门控通道基因和细胞为主的生物起搏在缓慢性心律失常治疗中必将占有一席之地。

全面性癫伴热性惊厥附加症电压门控钠离子通道基因的研究进展

全面性癫伴热性惊厥附加症(GEFS+)是国际抗癫联盟新近提出的一种新的癫综合征。在家系分析的基础上,目前GEFS+的遗传学研究主要集中在基因定位方面,研究表明GEFS+与编码电压依赖性Na+通道(SCN)基因突变有关。现就GEFS+与SCN1B、SCN2B、SCN1A、SCN2A基因突变的关系进行综述,旨在提高对本病的认识。

肌阵挛-站立不能性癫痫的临床特征及其电压门控性钠通道α1亚基基因突变检测

目的探讨肌阵挛-站立不能性癫痫（MAE）的临床特点、药物疗效及可能的分子遗传学机制。方法根据2001年国际抗癫痫联盟癫痫综合征分类标准对自2006年至2008年在广州医学院第二附属医院神经内科就诊的MAE患者进行诊断，收集患者的临床资料及外周血DNA，采用高效液相色谱分析和直接测序法对电压门控性钠通道α1亚基（SCNIA）基因突变进行筛查，并对其临床治疗情况随访1年以上。结果共收集10例MAE患者，其中散发8例，有热性惊厥或癫痫家族史者2例；起病年龄介于5～39个月间；有多种全面性发作形式；2例曾出现癫痫持续状态；起病后精神发育迟滞者7例。对其中8例患者进行SCNIA基因突变筛查，均未发现突变。丙戊酸、氯硝安定和左乙拉西坦疗效最好．部分患者托吡酯和拉莫三嗪治疗亦有效。结论MAE是少见的癫痫综合征，分子遗传学机制不明，丙戊酸、氯硝安定和左乙拉西坦治疗有效，但预后较差。

电压门控氯离子通道7基因致综合征性耳聋相关骨硬化症机制的研究进展

电压门控氯离子通道7(chloride voltage-gated channel 7,CLCN7)基因突变可使陷窝内酸化不能,造成骨溶解障碍,从而导致以全身骨密度增高为特征的骨硬化症及溶酶体储积疾病等。而硬化骨压迫损伤神经、中耳负压及耳硬化等均可导致耳聋。该文将介绍CLCN7基因及CLCN7蛋白结构功能、骨溶解过程(包括破骨细胞简介和骨溶解机制)、骨硬化症、CLCN7基因突变致骨硬化症的机制及其治疗以及骨硬化症与综合征性耳聋,以期为临床诊断及治疗提供依据。

HCN4基因在大鼠心脏不同发育时期的表达

目的探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)基因在大鼠心脏发育过程中心房、心室中的表达及其在心脏发育过程中的意义。方法取妊娠15、19d(E15、E19)胎鼠和出生2、10、35、90d(P2、P10、P35、P90)幼鼠心脏,于体视显微镜下分离其心房和心室。抽提总RNA,应用RT-PCR法对HCN基因mRNA表达进行半定量分析;抽提膜蛋白,应用Westernblot方法对HCN蛋白的表达进行半定量分析,应用SPSS11.5软件进行统计学分析。结果HCN4基因mRNA和HCN4基因蛋白在大鼠各时间点心房和心室中均有表达。心房或心室内HCN4基因mRNA在P10、P35、P90时两两比较均无显著性差异(Pa>0.05);E15、E19、P2、P10两两比较均有显著性差异(Pa<0.05)。心房HCN4基因mRNA及其蛋白相对表达量(HCN4/β-actin)均较同日龄心室高,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。心房或心室内HCN4基因mRNA在E15时均表达最高,在E19、P2、P10时表达逐渐降低,与E15比较差异有统计学意义(P<0.05)。心脏发育后期(P35、P90)表达量趋于平衡。Westernblot与RT-PCR结果基本一致。结论随着大鼠心脏的发育成熟,HCN4基因在心房和心室的表达呈逐渐下调趋势,可能与大鼠心脏的发育成熟密切相关。

海南省三亚市中华按蚊抗药性及抗性相关基因突变调查

目的了解海南省三亚市中华按蚊对常用杀虫剂的抗性状况及电压门控钠离子通道(VGSC)击倒抗性(kdr)相关基因及编码乙酰胆碱酯酶(AChE)的ace-1基因的突变情况。方法分别于2018年9-10月和2020年9月在海南省三亚市天涯区采集中华按蚊成蚊,用生物测定法测定其对5种常用杀虫剂的抗药性。抽取抗性测定后存活样品,以直接测序法对VGSC基因1014位点和ace-1基因119位点的突变进行检测。结果2018和2020年中华按蚊对0.05%溴氰菊酯和4.00%滴滴涕(DDT)均产生抗性,24 h死亡率分别为43.00%、11.11%和71.00%、39.18%;该蚊对5.0%马拉硫磷由2018年的可能抗性(91.00%)到2020年的敏感(100%)。PCR产物测序结果显示VGSC基因1014位点和ace-1基因119位点分别发现1种突变基因,即L1014F亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)(TTG突变为TTT)和G119S甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)(GGC突变为AGC),2018和2020年突变频率分别为48.75%、57.14%和52.50%、43.75%。结论海南省三亚市中华按蚊对溴氰菊酯、DDT等产生抗性,而对马拉硫磷、醚菊酯、溴虫腈较敏感。抗性基因突变可能是导致中华按蚊产生抗药性的重要原因。

体外诱导心肌样细胞中HCN4过表达对起搏电流特性的影响

目的体外构建具有表达功能性的起搏心肌样细胞,并检测起搏心肌样细胞中起搏电流的特性。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞。构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体(rAd/GFP/HCN4)和绿色荧光蛋白的腺病毒载体(rAd/GFP),转染至心肌样细胞分为rAd/GFP/HCN4组和rAd/GFP组,不做任何处理作为对照组。Western blot检测各组HCN4蛋白表达,全细胞膜片钳技术记录各组中起搏电流情况。结果荧光显微镜观察到长梭形心肌样细胞,PCR鉴定重组腺病毒载体rAd/GFP/HCN4和rAd/GFP构建成功;rAd/GFP/HCN4组HCN4蛋白相对表达量(1.31±0.02)高于rAd/GFP组(0.55±0.02)和对照组(0.52±0.03)(P<0.05),rAd/GFP组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);膜片钳实验在转基因细胞中检测到起搏电流,而rAd/GFP组和对照组中未检测到起搏电流。结论 rAd/GFP/HCN4转染到心肌样细胞中,心肌样细胞中HCN4蛋白表达增加且可检测到起搏电流,从而使心肌样细胞具有自主搏动,为体外构建生物起搏器提供研究基础。

腺病毒介导的hHCN4表达载体的构建及其转染人胚肾细胞

目的构建人超极化激活环核甘酸门控通道基因4(hHCN4)的重组腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP,并对其进行鉴定、包装。方法利用Gateway技术构建pAV-hHCN4-IRES/eGFP,酶切鉴定并进行阳性克隆测序。将构建好的质粒转染人胚肾细胞HEK293,检测病毒液滴度。结果测序符合Genbank中的hHCN4的编码序列。转染HEK293细胞见绿色荧光蛋白表达,病毒滴度为1.26×108 pfu/ml。结论成功构建了重组腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP。