血管扩张刺激磷蛋白调节失血性休克大鼠小肠屏障功能与闭锁连接蛋白1的关系

目的观察血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP)调节失血性休克大鼠小肠屏障功能与闭锁连接蛋白1(ZO-1)的关系。方法采用失血性休克大鼠模型,以血浆D-乳酸含量反映肠屏障功能,观察失血性休克后大鼠小肠上皮黏膜VASP表达和磷酸化的变化、ZO-1的表达变化以及肠屏障功能变化,比较变化趋势,并观察失血性休克加入VASP磷酸化激动剂后对上述分子表达和肠屏障功能的影响。结果①与正常对照组相比,失血性休克后大鼠小肠黏膜VASP蛋白表达明显降低(P<0.01),VASP蛋白磷酸化在正常时表达量低,休克1h时增高,2～4h迅速降低(P<0.01);ZO-1表达随着休克时间的延长显著降低,在休克2h时降低明显(P<0.01);血浆D-乳酸含量在休克1h改变不明显,2～4h显著增高(P<0.01)。②VASP磷酸化激动剂cAMP可明显增强失血性休克2h大鼠小肠上皮VASP蛋白表达和VASP磷酸化、ZO-1的表达,降低失血性休克2h大鼠血浆D-乳酸含量增高幅度(P<0.01)。结论ZO-1可能与VASP对失血性休克大鼠肠屏障功能的调节作用有关。

闭锁连接蛋白-1 核酸适配体的筛选与初步应用

基于配体指数富集系统进化技术筛选闭锁连接蛋白-1的核酸适配体,最终筛选到15条ZO-1的核酸适配体(APTZO-1).排除线性结构与相似结构后,采用酶联免疫吸附法表征了9条APTZO-1与ZO-1亲和力的大小,排序依次为:APTZO-18>APTZO-12>APTZO-17>APTZO-113>APTZO-11>APTZO-15>APTZO-115>APTZO-112>APTZO-14.采用Cy5荧光基团标记APTZO-18(Cy5-APTZO-18),证实了其能对人结直肠腺癌细胞(Caco-2)与人脑微管内皮细胞(hCMEC/D3)的ZO-1进行荧光定位与半定量分析,且与基于ZO-1抗体法的免疫荧光与蛋白印迹实验结果基本相似.本研究首次筛选到了ZO-1的系列核酸适配体,有望为ZO-1的荧光标记与半定量分析提供一种新型的、特异性高的工具分子.

低聚壳聚糖硒抗玉米赤霉烯酮对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达的影响

试验旨在探究低聚壳聚糖硒抗玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEN)对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)紧密连接蛋白表达的影响。试验分为对照组(C)、ZEN(30μg/mL ZEN)、ZEN+0.5 Se(30μg/mL ZEN+0.5μmol/L低聚壳聚糖硒,以Se计)、ZEN+1.5 Se和ZEN+3 Se组。待细胞长至60%~70%汇合时,ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se和ZEN+3 Se组培养液更换为含对应Se浓度的培养液,C和ZEN组更换为正常培养液,12 h后向含ZEN组加入30μg/mL ZEN,继续培养24 h。收集各组细胞培养液,检测碱性磷酸酶(AKP)活性;Western blotting法检测闭锁连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)的表达,免疫荧光法检测ZO-1和Occludin蛋白的表达和定位情况。AKP活性检测结果表明,与对照组相比,ZEN、ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se组AKP活性均显著升高(P<0.05),ZEN+3 Se组AKP活性差异不显著(P>0.05);与ZEN组相比,ZEN+1.5 Se和ZEN+3 Se组AKP活性均显著降低(P<0.05)。Western blotting检测结果表明,与对照组比,ZEN组ZO-1和Occludin蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与ZEN组比,ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se和ZEN+3 Se组ZO-1表达水平均差异不显著(P>0.05),但随着Se浓度的增加,ZO-1表达水平逐渐升高,ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3 Se组Occludin表达水平均显著升高(P<0.05)。免疫荧光结果表明,低聚壳聚糖硒可缓解ZEN引起的ZO-1和Occludin蛋白荧光信号减弱现象,并恢复ZO-1和Occludin蛋白的定位分布。由此说明,低聚壳聚糖硒可降低ZEN引起的IPEC-J2细胞AKP活性升高,上调ZEN引起的ZO-1、Occludin蛋白表达水平下降,并调节其定位分布。

探讨益气温阳方抑制变应性鼻炎小鼠鼻黏膜细胞自噬及保护ZO-1及occludin的作用

目的 观察益气温阳方(黄芪、党参、干姜、桂枝、麻黄、辛夷、五味子、地龙、甘草)对变应性鼻炎小鼠模型的治疗效果和对鼻黏膜细胞抑制自噬、保护紧密连接关键蛋白——闭锁连接蛋白1(ZO-1)及闭合蛋白(occludin)的影响。方法 将30只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为6组:空白组,模型组,益气温阳方低、中、高剂量组(7、14、28 g/kg)及西替利嗪组(1.667 mg/kg),每组5只。卵清蛋白腹腔注射加鼻部激发致敏造模,鼻部激发致敏前1 h灌胃给药,共7 d。对小鼠行为进行评分。采集小鼠鼻黏膜组织,HE染色观察鼻黏膜炎症反应,过碘酸希夫染色观察鼻黏膜杯状细胞增生情况,酶联免疫吸附测定法检测鼻腔灌洗液IgE含量,免疫组化法检测空白组、模型组、益气温阳方高剂量组鼻黏膜中ZO-1及occludin蛋白表达,蛋白质印迹法检测鼻黏膜中自噬微管相关蛋白轻链β3(LC3B)、P62及Beclin1蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组小鼠行为学总分升高(P<0.01),挠鼻、喷嚏、流涕各项评分增加。鼻黏膜上皮中断、被破坏,大量炎性细胞浸润,杯状细胞增生,黏液分泌增多,黏膜肿胀明显,鼻腔灌洗液中IgE含量增加(P<0.01)。鼻黏膜中ZO-1、occludin蛋白表达减少(P<0.05)。LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达增加(P<0.05),P62蛋白表达减少(P<0.05)。给药干预后,与模型组比较,益气温阳方高剂量组和西替利嗪组小鼠行为学总分降低(P<0.01),鼻黏膜肿胀减轻,炎性细胞浸润和杯状细胞数量减少,鼻腔灌洗液中IgE含量减少(P<0.01),鼻黏膜中ZO-1、occludin蛋白表达增加(P<0.05)。益气温阳方高剂量组小鼠LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达减少(P<0.05),P62蛋白表达增加(P<0.05)。结论 益气温阳方对变应性鼻炎小鼠具有良好的治疗效果,该作用机制可能与其抑制鼻黏膜细胞自噬从而促进鼻黏膜修复相关。

参苓白术散对克罗恩病大鼠肠黏膜屏障的影响

目的观察参苓白术散对克罗恩病(Crohn's disease,CD)大鼠肠黏膜屏障的影响。方法60只SD大鼠随机均分为空白组、模型组、美沙拉秦组(0.21 g·kg^(-1)·d^(-1))及参苓白术散高、中、低剂量组(5.88、11.76、23.52 g·kg^(-1)·d^(-1))。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-three nitrobenzene sulfonic acid,TNBS)灌肠液制作CD模型。给药各组予以相应药物灌胃,空白组、模型组予以等剂量灭菌注射用水。监测每组大鼠在用药期间的体征变化,14 d后进行结肠黏膜损伤指数(colon injury morphology index,CMDI)评分、组织病理学观察,qPCR检测闭合蛋白(Occludin)、闭锁连接蛋白-1(zonulaoccludens-1,ZO-1)及E-钙黏蛋白(E-cadherin)的mRNA表达水平,Western blot法检测各组大鼠结肠组织中Occludin、ZO-1、E-cadherin蛋白表达水平。结果与空白组对比,模型组大鼠体质量明显下降,活动能力减弱,普遍出现稀便情况,少量大鼠出现便血及黏液便情况;CMDI评分显著升高(P<0.01);黏膜可见上皮坏死脱落,内部腺体坏死,大量炎性细胞浸润;Occludin、ZO-1、E-cadherin的mRNA水平及蛋白表达均明显降低(P<0.01)。与模型组对比,美沙拉秦组及参苓白术散低、中、高剂量组大鼠体质量不同程度升高,大便基本成形,个别大鼠有少量便血,无明显黏液便;美沙拉秦组及参苓白术散高、中剂量组CMDI评分均降低(P<0.01),结肠黏膜损伤明显减轻;参苓白术散高剂量组Occludin、ZO-1、E-cadherin的mRNA水平及蛋白表达显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论参苓白术散可能通过调控Occludin、ZO-1及E-cadherin mRNA及蛋白的表达,促进CD大鼠结肠黏膜屏障功能的修复,有效缓解CD大鼠肠黏膜屏障损伤。

腹部推拿对非酒精性脂肪性肝病大鼠肠道黏膜F-actin、ZO-1、E-钙黏蛋白表达及超微结构的影响

目的:研究腹部推拿对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肠道黏膜的蛋白闭锁连接蛋白-1(ZO-1)、E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、多聚体纤维状肌动蛋白(F-actin)蛋白及超微结构的影响。方法:建立NAFLD大鼠模型,随机分为腹部推拿组和模型对照组,每组9只,另设9只大鼠为正常对照组。腹部推拿组每天推拿干预10 min;模型对照组每日束缚大鼠,10 min后解开束缚;正常对照组不予任何干预手段。干预4周后,利用免疫组化方法检测肠黏膜F-actin、ZO-1、E-Cadherin蛋白表达;同时,利用透射电镜观察大鼠的肠黏膜组织超微结构。结果:造模后F-actin和ZO-1蛋白免疫组化染色为阴性;腹部推拿干预后,F-actin和ZO-1蛋白免疫组化染色为阳性;而E-Cadherin蛋白在造模后及腹部推拿干预后,染色结果均为阳性;同时,通过透射电镜观察肠道黏膜组织,造模后细胞结构及线粒体等细胞器超微结构被破坏,而腹部推拿组通过干预可有一定程度的结构改善。结论:腹部推拿可上调F-actin和ZO-1蛋白含量,修复肠道黏膜组织结构,以改善NAFLD大鼠肠道黏膜通透性,逆转NAFLD的脂肪变性。

加味四君子汤对脑缺血大鼠脑组织Occludin,ZO-1,Claudin-1蛋白及其mRNA表达的影响

目的:探讨加味四君子汤对脑缺血大鼠脑组织闭合蛋白(Occludin),密封蛋白-1(Claudin-1),闭锁连接蛋白-1(ZO-1)表达的影响,并探讨相关的作用机制。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,依达拉奉组(3.2×10-3g·kg-1),加味四君子汤加减低、中、高剂量组(4.77,9.54,19.08 g·kg-1)。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,治疗7 d后处死,运用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠缺血侧脑皮质区Occludin,ZO-1,Claudin-1蛋白的表达,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠缺血侧脑皮质区Occludin,ZO-1,Claudin-1 mRNA表达。结果:与假手术组比较,模型组Occludin,Claudin-1,ZO-1蛋白显著减少(P<0.01);与模型组比较,依达拉奉组、加味四君子汤各剂量组Occludin,Claudin-1,ZO-1蛋白均显著增高(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠Occludin,Claudin-1,ZO-1 mRNA表达下调(P<0.01);与模型组比较,依达拉奉组、加味四君子汤各剂量组大鼠Occludin,Claudin-1,ZO-1 mRNA表达上升(P<0.01)。结论:加味四君子汤可能通过增加紧密连接蛋白Occludin,ZO-1,Claudin-1的表达,保护血脑屏障,减轻缺血性脑卒中大鼠脑水肿。

健脾益气利水方对脑缺血大鼠脑水肿及其脑组织Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达的影响

目的:探讨健脾益气利水方(JPF)对脑缺血大鼠脑水肿及脑组织紧密连接蛋白闭合蛋白(Occludin)、密封蛋白-1(Claudin-1)、闭锁连接蛋白-1(ZO-1)表达的影响。方法:将105只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,依达拉奉组,JPF小、中、大剂量组。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,治疗7d后处死,运用伊文思蓝(EB)渗出法检测血脑屏障的通透性,运用免疫组化法检测大鼠缺血侧脑组织Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组缺血侧脑组织EB的含量显著增加(P<0.01),Occludin、Claudin-1、ZO-1阳性细胞表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,依达拉奉组和JPF中、大剂量组大鼠缺血侧脑组织EB的含量明显降低(P<0.05),各给药组Occludin、Claudin-1、ZO-1阳性细胞表达明显增强(P<0.01,P<0.05)。结论:健脾益气利水法组方可能通过上调紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表达保护血脑屏障,减轻脑缺血再灌注大鼠脑水肿。

桃红四物汤抗癫痫作用机制研究

目的研究桃红四物汤的抗癫痫作用机制。方法建立戊四氮(PTZ)点燃大鼠癫痫模型,随机分为对照组、模型组和桃红四物汤低、中、高剂量组。桃红四物汤剂量分别为0.7、1.4、2.1 g/kg,给药体积为10 m L/kg,每日ig给药1次,连续给药2周。给药第0、14天观察大鼠癫痫发作程度。给药结束处死大鼠,伊文思蓝(EB)法测定血脑屏障通透性,Western blotting法和免疫荧光法测定脑组织及不同部位3种紧密连接蛋白:闭锁连接蛋白-1(ZO-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Occludin蛋白表达水平。结果高、中、低剂量桃红四物汤可显著降低大鼠癫痫发作程度和血脑屏障通透性(P<0.01)。低剂量桃红四物汤可显著升高大鼠脑组织皮层、海马及纹状体的MMP-9表达水平(P<0.05);中、高剂量桃红四物汤可显著升高大鼠脑组织ZO-1、MMP-9、Occludin表达水平(P<0.05、0.01)。结论桃红四物汤可显著减轻癫痫发作程度,作用机制可能与降低血脑屏障通透性及升高脑组织紧密连接蛋白表达水平有关。

葛根芩连汤调控MMP-9/p38 MARK途径修复溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜上皮屏障功能

目的:探讨葛根芩连汤对溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠黏膜上皮屏障功能的保护作用,并通过基质金属蛋白酶-9(MMP-9)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路探究其治疗UC的作用机制。方法:48只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组(0.3 g·kg^(-1))及葛根芩连汤高、中、低剂量组(2.84,1.42,0.71 g·kg^(-1))。采用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液构建UC小鼠模型,葛根芩连汤和柳氮磺吡啶于造模后第8天灌胃给药,连续7 d,正常组给予等量生理盐水处理。末次给药后取结肠组织,苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织病理变化,免疫组化(IHC)观察结肠组织紧密连接(TJ)蛋白,如闭合蛋白(Occludin),闭锁连接蛋白-1(ZO-1)的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测结肠组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL-1β),MMP-9 mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中磷酸化(p)-p38 MAPK,p38 MAPK和MMP-9蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠体质量显著下降(P<0.01),疾病活动指数(DAI)评分显著升高(P<0.01),结肠黏膜上皮破损并可见黏膜和黏膜下层炎细胞浸润明显,Occludin,ZO-1蛋白表达显著降低(P<0.01),TNF-α,IL-1β,MMP-9 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),p-p38 MAPK和MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,柳氮磺吡啶组、葛根芩连汤各剂量组小鼠体质量和DAI评分均有明显改善(P<0.05,P<0.01),结肠组织损坏明显改善,Occludin,ZO-1蛋白明显增多(P<0.05,P<0.01),TNF-α,IL-1β,MMP-9 mRNA相对表达量显著下降(P<0.01),p-p38MAPK和MMP-9蛋白表达显著下降(P<0.01),其中葛根芩连汤各组中以中剂量组的变化最为明显。结论:葛根芩连汤能够通过抑制MMP-9和炎性细胞因子TNF-α,IL-1β的表达,阻断p38 MAPK信号通路的激活,增加TJ蛋白的表达,从而修复肠道黏膜屏障功能。

基于TGR5及肠黏膜屏障功能探讨“疏肝健脾”疗法对肝损伤大鼠的影响及作用机制

目的:探讨"疏肝、健脾、疏肝健脾、先疏肝再疏肝健脾、先健脾再疏肝健脾"不同治疗方法对肝郁叠加肝损伤大鼠的影响及其作用机制。方法:制造6周肝郁叠加肝损伤大鼠模型,采用束缚叠加四氯化碳(CCl4)皮下注射法造模(5.89 g·kg^(-1),1次/3 d),同时灌胃给药。48只清洁级雄性SD大鼠用随机数字表法分为8组:正常组,模型组,双环醇组(0.2 g·kg^(-1)),四逆散组(4.32 g·kg^(-1)),六君子汤组(9.26 g·kg^(-1)),柴芍六君子汤甲组(柴甲组;疏肝健脾,13.57 g·kg^(-1)),柴芍六君子汤乙组(柴乙组;先疏肝,再疏肝健脾,13.57 g·kg^(-1)),柴芍六君子汤丙组(柴丙组;先健脾,再疏肝健脾,13.57 g·kg^(-1)),每组6只。光镜、电镜下观察各组大鼠肝、结肠组织切片;全自动生化分析仪检测血清肝功能生化指标;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝脏、结肠组织G蛋白偶联受体5(TGR5),肠黏膜闭锁连接蛋白-1(ZO-1),闭合蛋白(Occludin),紧密连接蛋白-1(Claudin-1)mRNA相对表达量;免疫组化法检测结肠增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达率。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清碱性磷酸酶(ALP),丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBIL),直接胆红素(DBIL)水平显著升高(P<0.01),肝脏组织TGR5 mRNA表达显著降低,结肠组织TGR5 mRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),结肠ZO-1,Occludin,Claudin-1 mRNA及PCNA表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,双环醇、柴丙组血清ALP,ALT,AST,TBIL,DBIL水平明显降低(P<0.05,P<0.01),六君子汤组、柴甲、柴乙、柴丙组肝脏组织TGR5 mRNA肝脏表达显著升高,结肠组织TGR5 mRNA的表达显著降低(P<0.01),双环醇组、柴甲、柴乙、柴丙组结肠ZO-1,Claudin-1 mRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),双环醇组、四逆散组、柴丙组PCNA表达显著升高(P<0.01);与柴丙组比较,双环醇组、四逆散组肝脏TGR5,结肠ZO-1 mRNA表达显著降低且结肠TGR5mRNA表达显著升高(P<0.01),六君子汤组、柴乙组结肠PCNA表达明显降低(P<0.05)。结论:肝损伤状态下进行先健脾治疗能减轻肝损伤,"健脾"治疗能提高肠黏膜紧密连接蛋白含量,进而改善胃肠道功能,这与TGR5激活进而改善肠黏膜屏障功能,促进肠干细胞更新并驱动损伤后的再生有关。