猪脂肪间充质干细胞的分离培养及其成脂分化

脂肪间充质干细胞(Adipose mesenchymal stemcell,AMSCs)是一类来源于脂肪组织并具有多向分化潜能的干细胞。近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,有望在研究与应用领域成为骨髓干细胞的替代物。猪是一种比啮齿类更接近人类的模式动物,具有较强的脂肪沉积能力。本研究探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向脂肪细胞诱导分化的条件。采用Ⅰ型胶原酶消化分离脂肪微管基质成分,传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记。取第3-7代AMSCs,采用不同方法诱导AMSCs向脂肪细胞分化,光学显微镜下可观察到诱导后的细胞内有高折光性的小脂滴出现,油红O染色成阳性,不同诱导方法诱导率不同。被诱导细胞用RT-PCR可检测到脂肪细胞分化标志基因LPL和PPARγ的表达。结果表明可以从脂肪组织中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度。CD44、CD105表达呈阳性,CD14、CD34、S-100、HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向脂肪细胞分化。

传代种植密度对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 :研究人间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)传代培养时 ,细胞种植密度对MSCs增殖及成骨诱导分化影响。方法 :将第 2代MSCs以 8× 10 3 /cm2 、 3× 10 3/cm2 、 8× 10 2 /cm2 密度接种 ,分析其生长曲线 ,并扩增培养 18d ,记录细胞扩增数量 ,再分析扩增后细胞的生长曲线和成骨诱导能力。结果 :人骨髓MSCs阴性表达ALP、CD3 4;在 8× 10 3/cm2 种植密度下 ,细胞倍增时间 40h ,18d后细胞数量扩增 (5 1± 13 )倍 ;在 3× 10 3 /cm2 种植密度下 ,细胞扩增 (2 8± 6)倍 ;在 8× 10 2 /cm2 种植密度下 ,细胞总数仅增加 (5± 3 )倍。在低密度下获得的细胞增殖能力强于高密度组 ,两组细胞均具有成骨诱导能力。结论 :种植密度对MSCs增殖有明显影响 ,快速扩增MSCs作为骨组织工程种子细胞 ,宜选择 8× 10 3 /cm2 种植密度。

5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞向肌细胞增殖及分化的影响

目的:探讨在不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞过程中, 其对干细胞增殖及分化的影响。方法:分离纯化鉴定4周龄Wistar大鼠骨髓MSCs,以不同浓度5-Aza作用,用四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力,观察细胞形态变化,通过RT-PCR及电泳测定诱导后大鼠的MSCs中骨骼肌肌动蛋白的表达。结果:0和1 μmol·L-1 5-Aza对细胞增殖无明显影响;随着5-Aza浓度的增高,MSCs 的增殖逐渐减弱;20～30 μmol·L-1 5-Aza对细胞有毒性作用,影响其增殖。3和6 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达;9和12 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达,该浓度作用9 d后有部分细胞体明显增粗,12 d有肌管样细胞出现。结论:5-Aza影响干细胞分化,调控基因的表达及调控MSCs向肌细胞定向分化为肌管样细胞的过程。

非接触共培养法诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化

背景:最近研究表明将乳鼠心肌细胞和骨髓间充质干细胞非接触共培养后,可成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞。目的:尝试通过非接触共培养方式,利用人脐静脉内皮细胞诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化。设计、时间及地点:细胞组织工程学体外实验,于2007-01/07在广东省人民医院医学研究中心完成。材料:骨髓标本来源于11例无血液系统疾病的先天性心脏病患儿,征得家属同意后在心脏矫治手术中从胸骨柄穿刺获取少量骨髓用于实验。足月顺产健康新生儿脐带由中山大学附属一院产科协助取得。新鲜牛颈静脉由广东大沥菜牛屠宰厂提供。方法:取骨髓标本,以密度梯度离心法分离纯化人骨髓间充质干细胞,并在体外扩增培养;以酶消化法自新生儿脐带获取人脐静脉内皮细胞。采用具有半透膜的细胞培养池结合6孔板的方式进行非接触共培养诱导,将人脐静脉内皮细胞铺于培养池内,第3代骨髓间充质干细胞以1×105/孔铺在培养池外的6孔板内,两种细胞的初始比例为1:5,加入含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液,培养14d。以骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞共培养作为对照组。诱导后的内皮样细胞扩增培养,种植在脱细胞牛颈静脉血管支架上。主要观察指标:诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后内皮样细胞表面相关抗原,扫描电镜观察内皮样细胞在血管支架上的生长黏附情况。结果:诱导后的内皮样细胞形态均一,呈铺路石状排列,扩增迅速,表达内皮细胞特有的表面标志CD31和vWF,阳性率均>99%,可以在脱细胞牛颈静脉血管支架表面形成连续的单细胞层。结论:非接触共培养方式下,人脐静脉内皮细胞可成功诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并能够在脱细胞牛静脉血管支架上黏附生长。

骨髓间充质干细胞体外培养分化为肌原性细胞的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为心肌细胞的可行性。方法 由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞 ,培养传代后用 5 -氮杂胞苷诱导 2 4h ,免疫组化检测诱导后细胞的变化。结果 5 -氮杂胞苷诱导后的细胞经免疫组化检测可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色。结论 骨髓间充质干细胞可在体外经 5 -氮杂胞苷诱导后转化为肌原性细胞。

以内皮细胞基础培养液复合不同方法培养犬脐血间充质干细胞的比较(英文)

背景:内皮细胞基础培养液主要用于培养内皮祖细胞,作者所查用此液培养间充质干细胞的报道较少。目的:对以内皮细胞基础培养液为基础的不同方法培养脐血间充质干细胞的效果比较。设计、时间和单位:对比观察的细胞培养实验,于2005-09/2006-05在上海市新华医院市级重点实验室完成。材料:选取妊娠杂交犬8只,抽取脐血进行干细胞的分离和培养。内皮细胞基础培养液及内皮细胞培养基为美国Clonetics产品。鼠抗CD11a单克隆抗体,鼠抗CD11b单克隆抗体,鼠抗CD29单克隆抗体,鼠抗CD71单克隆抗体均为美国Antibodydiagnostica产品;鼠抗CD34单克隆抗体为美国LabVisionCorporation产品。方法:收集的脐血干细胞分为A,B,C,D4组。A组用内皮细胞基础培养液培养;B组用添加有微血管内皮细胞生长培养液的内皮细胞基础培养液在6孔板上培养。C组用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液在纤维连接蛋白包被的6孔板上培养。D组用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液在25cm2细胞培养瓶中培养。主要观察指标:观察各组细胞形态学变化和群体倍增数。应用免疫组化法检测细胞抗原CD11a、CD11b、CD34、CD29及CD71的表达。结果:各组均有成纤维细胞样细胞培养出。A组细胞形态不良,增殖缓慢;B组细胞增殖旺盛;C组细胞克隆不稳定,容易老化;同时出现另一种细胞克隆。D组细胞培养的结果与C组相似。免疫组化法检测抗原显示CD11a(-),CD11b(-),CD34(-),CD29(+)及CD71(+)。结论:在未经处理的6孔板上,用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液细胞培养液可以培养出生长良好、增殖旺盛的间充质干细胞。应用纤维连接蛋白和25cm2细胞培养瓶培养的效果不佳。

黄芪和三七对下肢缺血患者骨髓间充质干细胞体外分化的影响(英文)

背景：目前临床观察已经证实中药黄芪、三七能够改善下肢缺血症状，假设这种治疗作用与其促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化有关。目的：验证黄芪、三七是否能够有效促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化。设计、时间及地点：骨髓间充质干细胞的体外分化实验，于2005—04／06在北京中医药大学附属东直门医院教育部重点实验室完成。材料：抽取北京中医药大学东商门医院收治的下肢血管缺血性病变患者23例骨髓血，密度梯度法分离骨髓单个核细胞，即骨髓间充质干细胞。相当于生药材2g／mL的黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂产品，主要成分为三七总皂苷的血塞通粉针剂黑龙江珍宝岛制药有限公司产品，CD34抗体为美国BD公司产品，FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。方法：将骨髓间充质干细胞与3mL低、中、高剂量含生药4，12，36g/L的黄芪注射液，3mL低、中、高剂量含三七总皂苷50，100，200mg／L血塞通混悬液进行共培养，并设未加入药物的单纯培养干细胞为空白对照组；隔日换液一次，连续培养3周。主要观察指标：培养3周后，倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测CD34^＋细胞百分比。结果：①骨髓间充质干细胞培养3周后贴壁细胞大部分呈梭形，束状排列，具有内皮细胞形态和特性。②与空白对照组比较，黄芪低、中剂量组和三七中、高剂量组CD34^＋细胞百分比显著增加（P〈0．05～0．01）。结论：黄芪、三七有促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化的作用，此作用呈剂量依赖性。

不同传代倍数成人间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的:观察不同传代倍数成人骨髓间充质干细胞(MSC)定向诱导分化为成骨细胞的能力,为自体MSC修复骨组织损伤的临床应用提供部分参数。方法:采用全髓直接接种法分离培养胸科手术取下肋骨骨髓,贴壁细胞达90%以上融合时消化传代。传代细胞部分以1×106/ml的细胞密度接种于含100ml/L胎牛血消(FBS)的L-DMEM的培养基中继续培养,传代;部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松,β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。结果:5代以内成人MSC成骨分化能力无显著差异(P>0.05),以第3代最强,第6代后MSC成骨分化能力逐渐减弱。结论:不同代次的MSC诱导分化为成骨细胞的能力不同,6代以后明显减弱。做为组织工程的种子细胞,成人MSC体外培养不宜超过5代。

间充质干细胞的免疫调节作用与系统性红斑狼疮

间充质干细胞(MSC)是骨髓内除了造血干细胞之外的另一重要成分,近年来对MSC的研究越来越多,MSC具有体外扩增及多向分化的潜能,同时,MSC还具有低免疫原性以及免疫调节特性。本文综述了MSC免疫调节作用的研究现状及其在系统性红斑狼疮治疗中的应用前景。

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景:现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件,及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。设计、时间及地点:细胞形态学观察及蛋白分子水平检测,于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。材料:清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品,成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amresco产品。方法:Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞密度为5×107L-1。设立2组,诱导组用含10%胎牛血清和10μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24h后,再以含2%二甲基亚砜和200μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1,3,5h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。主要观察指标:细胞形态学变化,免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。结果:预诱导24h,胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形,伸出多个短棒状突起,可见2～3个核仁,细胞间漩涡状生长趋势消失,排列无规律;诱导1～3h,细胞逐渐变圆,胞质收缩明显,折光性增强,双级或多极的突起互相连接呈网状;诱导5h,突起出现一、二级分支。诱导1h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白;3h后巢蛋白达高峰,同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白;5h后巢蛋白表达下降,神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化,巢蛋白表达为阴性。结论:在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导,能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化,且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。

胎牛血清-Fe_2O_3标记骨髓间充质干细胞的实验研究

目的为骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体示踪实验提供一种新型、方便、快捷、可靠的标记方法。方法体外实验部分,Fe2O3分析纯饱和溶液与新鲜胎牛血清按一定比例充分混匀,再与豚鼠BMSCs孵育8h即可标记;体内实验部分,将胎牛血清-Fe2O3标记的豚鼠BMSCs注射到SD大鼠胸腺内,并将大鼠胸腺切片染色观察。结果胎牛血清-Fe2O3标记BMSCs的标记率达到100%,主要标记部位在细胞浆;胎牛血清-Fe2O3标记的BMSCs仍然具有向胸腺被膜细胞、胸腺细胞及血管壁细胞等细胞分化的功能,即对细胞的生存、生长、分化等生物学特性没有影响。结论胎牛血清-Fe2O3可以标记BMSCs,且对BMSCs的生物学特性没有影响。

成年大鼠骨髓间质干细胞的生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性。方法通过全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。应用流式细胞仪测定细胞周期,并研究其增殖及生长特征。结果原代及传代培养显示,10代以前的MSCs具有活跃的增殖能力,细胞周期分析显示有16.8%的MSCs处于S+G2/M期。MSCs细胞形态可呈梭形、圆形或椭圆形,经传代融合时呈漩涡状、菊花状排列。结论体外培养10代以前的MSCs生长稳定,增殖较快,为进一步开展中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。

无定形磷酸钙负载rhBMP-2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验

[目的]制备无定形磷酸钙(ACP)负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2/ACP)纳米缓释体并观察其细胞毒性,为进一步体内植入提供实验依据。[方法]采用湿化学法合成rhBMP-2/ACP纳米缓释体;兔间充质干细胞(BMSCs)与rhBMP-2/ACP纳米缓释体进行体外复合培养,观察细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达,检测材料的细胞毒性。[结果]材料浸提液对兔BMSCs的生长无影响,其细胞相对增殖率在100.2%～102.5%之间,细胞毒性评级为0级;BMSCs于复合材料表面的黏附、生长速度、形态与对照组无明显差别。[结论]rhBMP-2/ACP纳米缓释体无细胞毒性,复合培养不影响BMSCs的正常生理功能,细胞相容性良好。

大鼠骨髓间充质干细胞培养4周膜电流研究

目的:研究未经诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)培养4周(4～6代)膜电流特性,为移植细胞的选取和细胞移植后心肌电生理研究奠定基础。方法:按文献方法获得和培养MSCs至第4周,利用全细胞膜片钳技术对培养4周的MSCs膜电流进行检测,以各种钾钠钙通道阻滞剂对电流成分进行分析鉴定。结果:本实验成功封接并有电流表达细胞共39例,所有检测到的电流均以相应阻滞剂证实。共有4种钾电流表达即缓慢激活延迟整流钾电流、瞬时外向钾电流、超速激活延迟整流钾电流和内向整流钾电流(Ikir),3种外向钾电流在+60mV时电流峰值均值分别为(0.3894±0.1230)nA、(0.4135±0.1029)nA、(0.2570±0.1135)nA;Ikir在-120mV时电流大小为(0.9613±0.1484)nA;此外在极少数MSCs上检测到河豚毒素敏感的内向钠电流(ITTX.Na),未检测到内向钙电流。结论:培养4周后的MSCs存在钾钠电流的复合表达,从电生理角度看,MSCs有分化成功能性心肌样细胞的离子基础,其可作为体内移植较理想细胞选择。

成人股骨头坏死的治疗进展

股骨头坏死(ONFH)是一种进展性和致残性疾病,保存自身股骨头是临床治疗所追求的最理想目标,早中期的治疗方案主要采用非手术疗法和保髋的姑息性手术,目前为止还没有一种治疗方法能达到理想的治疗效果。近年来,骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗ONFH是目前研究热点之一,有望成为一种有效的治疗方法,晚期行人工髋关节置换术是唯一的和最佳的选择。因此,早期诊断,采用综合性治疗方案保全自身髋关节是治疗本病的主要方向。

大鼠ADSCs的生物学特性及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脂肪源性干细胞（ADSCs）的生长增殖活性以及成骨分化能力。方法取sD大鼠，无菌条件下取腹股沟部脂肪组织，制成单绷胞悬液进行常规培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，取第3代ADSCs，采用流式细胞技术检测细胞的增殖周期情况，茜素红染色观察诱导成骨情况。结果在倒置显微镜下所观察到的传代培养的ADSCs呈现长梭型及多角形的贴壁分布状态，形态大小比较均一，突起较少，并且增殖迅速，一般在3～4d即可生长汇合成单层、平行或者漩涡状排列。流式细胞仪检测细胞阳性率CD29为92．47％，CD44为90．05％，CD34为0．95％。或骨诱导21d，细胞钙结节形成明显，经茜素红染色出现红色结节的阳性染色，不加诱导剂的对照组染色为阴性。结论分离黏附细胞具有间充质干细胞的生物学特性，可以向成骨细胞分化。

电离辐射致股骨头坏死早期病理特点和机制的研究

目的观察单次大剂量射线引起大鼠股骨头坏死的早期病理改变，为放射性骨坏死特别是放射性股骨头坏死的早期诊断和防治研究提供依据。方法^137Csγ射线（30Gy）体外局部单侧单次照射大鼠股骨头，受照后2、6和12周取双侧股骨头HE染色，光镜观察病理改变；照后2周骨髓间充质干质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分离培养，观察BMSCs增殖和集落形成能力；照后12周血管内灌注Microfill造影剂，采用微CT对股骨头毛细血管网进行三维重建和分析。结果^137Csγ射线局部照射后，受照侧股骨头软骨柱紊乱，骨细胞核皱缩、数量减少、空骨陷窝增多、骨小梁面积减少（P〈0.05）；受照侧股骨头毛细血管密度由未照侧的12.3％降至6.65％（P〈0.05）；BMSCs生长缓慢，集落形成率为10％，较对照组（21％）明显下降（P〈0.05）。结论30Gy单次局部照射后骨组织病理改变主要表现为空骨陷窝增加，照射后6周空骨陷窝率达30％可作为放射性股骨头坏死早期预诊断的指标之一。辐射致股骨头损伤甚至坏死除了射线对骨组织的损伤外，还与射线对骨髓BMSCs和毛细血管的损伤有关。