间充质干细胞体外诱导生成软骨细胞的研究进展

关节软骨是一种特殊的结缔组织,具有连接、支持、分散应力、减小振荡等功能。关节软骨缺损通常由创伤及关节炎等原因引起,是一种常见的骨科疾病,由于软骨组织无血管、神经和淋巴管,同时软骨细胞代谢率低,加之在基质纤维网中的增生和迁移受限。

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的:研究人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的可行性。方法:由人脐静脉获得间充质干细胞,纯化培养后用不同浓度的5-氮杂胞苷(5-azacytidine)诱导,透射电镜、免疫组化及RT-PCR鉴定诱导后细胞。结果:经5-氮杂胞苷诱导后的脐带血间充质干细胞在透射电镜下观察到细胞内有明显的肌丝,横纹样结构形成,核呈卵圆形,位于细胞中央位置,胞质中可见富集的糖原颗粒及线粒体结构。免疫组化可见肌钙蛋白Ⅰ染色阳性。RT-PCR方法显示能表达缝隙连接膜通道蛋白Connexin-43基因。结论:人脐带血间充质干细胞可在体外经5-氮杂胞苷诱导分化为具有典型结构的心肌细胞。

人脐血间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞

目的:建立人脐血间充质干细胞(umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells,UCBMSC)的体外分离、培养方法,体外诱导UCBMSC分化为类肝细胞,观察UCBMSC细胞生物学特性,并对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定.方法:采用体外细胞培养技术,分离培养人脐血UCBMSC,在10g/LMatrigel作基质,2.5mmol/LAZA预处理10-12h,HGF10μg/L+FGF410μg/L+HGM培养基中诱导.用显微摄像和MTT研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学、RT-PCR鉴定细胞表型.采用ELISA法检测培养上清中人白蛋白水平.结果:每份脐血可获得150±20个贴壁细胞:细胞种植后6d达到对数生长期,连续传10代后,每份脐带血UCBMSC可扩增达109-1010个细胞.UCBMSC表型为CD44及CD166阳性,CD34及CD45阴性.在添加FGF4和HGF的Matrigel上诱导培养的UCBMSC在21-28d时,形态由长梭形变为三角形,多角形或类圆形.细胞转圆率为40-50%,双核细胞比率5-7%.免疫组化,RT-PCR检测显示未诱导培养的UCBMSC中,有较少的细胞表达AFP及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞质蛋白标志.诱导早期可见较多细胞表达GATA4,AFP和CK19及其mRNA,至诱导后期表达下降,而ALB,CK18,GST-π和肝细胞转录因子HNF1α表达逐渐上升.ALB,CK18阳性细胞比例达61-65%.未诱导分化的UCBMSC没有分泌ALB和产生尿素,诱导分化的UCBMSC以时间依赖方式产生白蛋白.结论:人脐血UCBMSC先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,获得了在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞,已具备肝细胞特有的分泌白蛋白功能.

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的 探索骨髓间充质干细胞 (MSCs)能否在体外诱导分化成神经样细胞 ,并初步探讨其分化机制。方法 培养大鼠MSCs,用二甲亚砜 (DMSO)和丁羟茴醚 (BHA)诱导分化 ,鉴定诱导分化前后的细胞是否表达神经细胞及神经干细胞的特异性标记蛋白 ,并研究其超微结构的变化。结果 诱导分化后 ,大部分MSCs变成双极、多极和锥形 ,并相互交织成网络结构 ,出现神经元特异性核蛋白 (NeuN)和巢蛋白 (Nestin)表达 ,无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和 2 3 环核苷酸磷酸二脂酶 (CNP)表达。部分MSCs转变为典型的神经元超微结构。结论 MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞。

成人脂肪间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分化为心肌样细胞,为心肌细胞的替代治疗提供新的来源。方法采用消化法和贴壁培养法分离培养ADMSCs,对第3代细胞进行免疫化学鉴定和5氮杂胞苷(5aza)诱导,于诱导后第7、14、21和28天行免疫化学鉴定,并测定GATA4和Nkx2.5表达和心房利钠肽(ANP)含量。结果人脂肪中含有梭形细胞,CD44、CD13、CD105阳性表达,而CD45、CD34、HLADR、Ⅷ因子阴性表达。诱导后细胞排列方向一致,部分细胞聚集成团;结蛋白、α横纹肌肌动蛋白、肌球蛋白重链和心肌肌钙蛋白T呈阳性表达。有GATA4和Nkx2.5的表达及心房利钠肽的分泌。结论成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可在5氮杂胞苷诱导21d后分化为心肌样细胞。

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞的实验

目的:探讨新西兰兔骨髓间充质干细胞在体外不同条件下定向分化为阴茎海绵体平滑肌细胞的可行性。方法:实验于2004-10/2005-05在中山大学第二附属医院实验中心完成。采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞;分别通过添加血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子进行体外直接诱导以及与阴茎海绵体平滑肌细胞不同比例(据骨髓间充质干细胞与阴茎海绵体平滑肌根细胞数量比,共培养诱导分为4∶1组、2∶1组以及1∶1组。每6孔作为1个诱导组,每孔兔骨髓间充质干细胞终浓度为1×10L-1,阴茎海绵体平8滑肌细胞相应终浓度分别为0.25×10L-1、0.5×108L-1及1×10L-1)进行88共培养两种方法诱导干细胞分化为阴茎海绵体平滑肌细胞。培养2d后的细胞爬片进行荧光免疫细胞化学染色测定抗α平滑肌肌动蛋白抗体表达,全程避光进行。完成染色后,立即进行激光共聚焦显微镜镜检。每孔爬片随机取5个视野,计算出每孔中Hoechst33342与FITC(Cy3)或双阳性细胞数及Hoechst33342单阳性的细胞数的比值以计算每孔的诱导率,应用SPSS软件进行完全随机设计的方差分析。结果:①阴茎海绵体平滑肌细胞的生长特性、形态及鉴定:组织块贴壁后细胞渐游出,呈梭形或长条形,原代细胞汇合90%约需16～19d,传代后生长加快,90%汇合时1∶2传代后约3d可再次传代。细胞融合时呈现典型的“峰-谷”样形态。传至10代之后细胞生长放缓,胞体渐变宽大,胞内颗粒增多。荧光免疫细胞化学检测特异性抗α平滑肌肌动蛋白抗体见绝大部分细胞呈阳性。②直接诱导以及共培养诱导的初步分析结果:骨髓间充质干细胞之细胞核标记良好,诱导后见胞浆表达多量抗α平滑肌肌动蛋白抗体,与阳性对照组相似;高倍镜下可清晰见平滑肌肌动蛋白肌丝,而阴性对照组只有核显色,无抗α平滑肌肌动蛋白抗体表达。③不同组别诱导率方差分析S-N-K检验得各组总体均数差异性检验的(F=44.831P<0.05),表明统计学上有显著性差异;共培养1∶1,组效率最高,依次是共培养2∶1组、共培养4∶1组,血管内皮生长因子组、血管内皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组最低,后两者间诱导效果在统计学上无差别。结论:骨髓间充质干细胞可通过添加生长因子和共培养的方法诱导分化为阴茎海绵体平滑肌细胞,其中以共培养的方法效率较高。

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形。14d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应。结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。

骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展

骨髓间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体,MSC既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性,获取简便,体外培养条件不高,分离增殖能力强,可以自身获取,因此它可以作为种子细胞。与造血干细胞相比,MSC在疾病治疗上更为理想。目前MSC及其在组织工程方面的研究已取得较大进展。

膜联蛋白A1在兔骨髓间充质干细胞体外诱导成骨和成脂早期的表达

背景:骨髓间充质干细胞分化过程中膜联蛋白A1表达变化的研究报道各有不同看法。目的:分析兔骨髓间充质干细胞在体外诱导成骨和成脂过程中膜联蛋白A1基因的表达变化。方法:应用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,分别加入含成骨诱导剂、成脂诱导剂及不添加任何诱导剂的培养基进行培养。结果与结论:膜联蛋白A1基因在成骨诱导过程中与未诱导细胞相比有明显下调趋势,差异有显著性意义(P<0.01),而在成脂诱导剂中则为上升(P<0.01)。成骨诱导剂对细胞生长存在抑制作用并增加细胞凋亡(P<0.01),而成脂诱导剂对细胞生长与凋亡作用较小(P>0.05)。因此排除了诱导剂对细胞的作用之后,推测膜联蛋白A1基因可能与骨髓间充质干细胞体外向脂肪细胞分化存在一定关系,但尚不能肯定其在成骨分化中的作用。

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的形态学观察

目的探讨5-氮胞苷(5-aza)对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外诱导作用。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代MSCs培养48h后加10μmol/L5-aza进行诱导,3周后刮取贴壁细胞,离心收集,免疫细胞化学检测心肌特异性蛋白α-actin的表达对所诱导细胞进行鉴定,电镜观察细胞超微结构。结果电镜下见胞质内出现大量肌丝,线粒体数量增多,分布在肌丝周围,可见细胞膜电子密度增高的缝隙连接;免疫细胞化学显示α-actin呈强阳性表达。结论MSCs经5-aza体外诱导分化,可获得形态上类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞。

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的方法。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代细胞培养48h,分为4组:A组加入心肌组织块条件培养液、B组加10μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)、C组为二者的混合液、D组不加任何诱导剂以作对照组。应用免疫细胞化学方法检测各组心肌特异性蛋白α-actin的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示,A组细胞培养3周时可检测到α-actin阳性细胞,阳性细胞较多;B组培养1周可见弱阳性细胞,随时间延长,阳性着色增强且阳性细胞数增多,3周时呈强阳性表达;C组2周即可检测到细胞呈强阳性着色。对照组MSCs胞浆内未检测到α-actin的表达。4个组的阳性细胞率进行两两比较均有统计学意义(P<0.05)。结论心肌组织块条件培养液和5-aza联合应用可促进MSCs体外分化为心肌样细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导后对糖尿病大鼠模型的治疗作用

对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养、体外扩增,采用含不同葡萄糖浓度的培养基加尼克酰胺、exendin-4向胰岛样细胞进行诱导。将诱导细胞通过尾静脉及肾包囊移植入糖尿病大鼠模型体内,通过对血糖的检测,观察诱导后细胞对糖尿病大鼠模型的治疗效果。发现大鼠BMSCs在尼克酰胺和exendin-4作用后,可通过尾静脉和肾包囊途径进入体内,分布在不同脏器,同时产生降低链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠血糖水平的作用。

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是否能体外诱导分化为心肌样细胞。方法用浓度梯度法分离和纯化Wistar大鼠MSCs,贴壁法培养,培养的第2代细胞分别用终浓度为0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μmol/L的5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导分化,用光学显微镜观察细胞的形态并用免疫细胞化学方法鉴定细胞内的心肌肌钙蛋白I(cardiac troponinI,cTnI)。结果以终浓度10.0μmol/L5-aza为诱导组,细胞从原来的梭形变为排列趋向较为一致的长梭形,且体积增大,诱导10d后,细胞内cTnI蛋白染色阳性。终浓度为0、0.1、1.0μmol/L组细胞形态变化不明显,细胞内cTnI染色阴性。终浓度为50.0、100.0μmol/L组细胞死亡。结论大鼠MSCs细胞可经5-aza诱导分化为心肌样细胞,且5-aza的最佳诱导浓度为10.0μmol/L。

增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌样细胞研究

急性心肌梗死后心肌细胞的数量减少，致使其向心力衰竭发展。但是现有的治疗手段并不能很好地解决心力衰竭问题，细胞替代治疗和基因治疗为心力衰竭的治疗带来了新的希望。而替代治疗的关键问题是种子细胞的选择。间充质干细胞（MSC）具有高度的自我更新和多向分化的潜能，被认为是理想的种子细胞和基因转移的载体细胞，但其在体内的转归是研究的难点。近期，我们采用不同浓度的转染液转染，以便确定转染浓度对转染效率的影响，并明确经蛋白标记后的心肌细胞是否可以稳定生长、建系并被在体外诱导为心肌细胞，以及微环境究竟如何诱导转染MSC在体外向心肌细胞分化，为进一步的体内研究提供实验依据。

脐血间充质干细胞体外诱导成肝细胞的研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞的一种,具有多向分化的能力,因其可以分化为间质组织而得名。间充质干细胞可以修复、重建受伤或病变的多种组织器官,可用于神经系统疾病、肌腱损伤、心肌损伤、角膜损伤、肝脏组织损伤等多种疾病的治疗。若从异体采集干细胞,则存在免疫排斥、寻找配型的问题;若从成人自体采集,则存在采集过程痛苦、采集点可能感染、细胞数量少、耗时长等问题。但若从脐血采集,则解决了上述所有问题。本文就近年来脐血间充质干细胞体外诱导成肝细胞的研究进展综述如下。

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经前体细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分化为神经前体细胞的能力。方法:原代:分离培养、鉴定;传代:在细胞因子和氧化剂作用下进行诱导。形态学观察,免疫细胞化学检测和流式细胞分析。结果:成功进行了BMSCs的原代和传代培养,诱导后有神经前体细胞产生,诱导后5小时平均分化率最高,约为49.79%。结论:BMSCs可进行体外分离、扩增,并能诱导分化为神经前体细胞。

盛志勇院士和付小兵教授采用自体骨髓间充质干细胞体外诱导培养汗腺:破解烧伤愈后排汗难题

大面积深度烧伤患者救治成活后如何解决排汗问题，一直是世界烧伤医学界的一大难题。在近期出版的国际权威医学期刊《创面修复与再生》杂志发表著名烧伤专家盛志勇院士和付小兵教授：经对12例烧伤志愿者临床试验，证明了采用自体骨髓间充质干细胞体外诱导培养汗腺获得成功。此项研究并被该杂志主编称为“一项具有里程碑意义的研究”。

解放军总医院第一附属医院骨髓间充质干细胞体外诱导培养汗腺获成功

近日，解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所采用自体骨髓问充质干细胞体外诱导培养汗腺获得成功。此突破表明，大面积深度烧伤患者救治成活后因汗腺破坏而无法排汗的世界性难题有望得到解决。据著名烧伤外科专家盛志勇院士介绍，我国大面积烧伤救治成功率达99。5％，烧伤LA50达99．8％，居国际领先水平。但深ll度以上的大面积烧伤患者由于汗腺被破坏而无法排汗，严重影响生活质量，尤其是夏天，病人更是难以耐受。近年来，世界各国对替代皮肤的研究不断获得新的进展，

调整细胞培养条件提高间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的潜能

背景:间充质干细胞外泌体有望发展成为治疗骨关节炎的无细胞疗法,而通过调整细胞培养条件,可以进一步提高其治疗活性和临床转化潜能。目的:综述分析细胞培养条件对外泌体活性的影响,分析其临床转化潜力。方法:查阅国内外有关骨关节炎/软骨损伤修复与间充质干细胞来源外泌体的文献。检索词分别为“外泌体,间充质干细胞,骨关节炎,软骨修复”和“exosomes,extracellular vesicles,mesenchymal stem cells,osteoarthritis,cartilage repair”,检索数据库分别为PubMed和中国知网数据库,检索时限为2010-2023年,最后纳入100篇文献进行总结和分析。结果与结论:(1)在间充质干细胞的培养过程中,提供有利于软骨细胞生长的物理环境,或添加软骨保护小分子、成软骨诱导因子和炎症因子等刺激细胞,可以进一步提高间充质干细胞外泌体在维持软骨细胞表型、促进软骨再生和免疫抑制等方面的调控活性;因此,其他具有相似特征的物理或化学因素,也有可能提升间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的疗效。(2)低氧诱导、脉冲电磁场刺激、生物反应器及软骨保护分子(如人甲状旁腺素1-34)刺激等细胞培养方案具有安全、可规模化生产等优点,可用于制备临床用途的、疗效好的间充质干细胞外泌体。(3)间充质干细胞外泌体有望实现骨关节炎的修正治疗,通过调整细胞培养方案提升治疗活性,可进一步提高其临床转化的可行性。