CXCR4基因修饰对骨髓间充质干细胞向急性肾损伤微环境定向迁移的放大效应及机制

目的:低氧/复氧预处理肾小管上皮细胞(HR-RTECs)体外模拟急性肾损伤(AKI),与CXCR4基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养,观察该共培养环境下CXCR4基因修饰对BMSCs定向迁移力的影响,探讨其可能机制,并以动物模型进一步验证。方法:Gateway技术构建含CXCR4目的基因的质粒[绿色荧光蛋白(eGFP)为示踪基因)],同时构建仅含eGFP的对照载体,以携带上述质粒的慢病毒为载体转染BMSCs合成CXCR4-BMSCs和null-BMSCs,检测转染细胞活力、分化潜能及CXCR4在转染细胞中的表达。RTECs于HR环境中各培养12h获得HR-RETCs。实验共分四组,将BMSCs、CXCR4-BMSCs、null-BMSCs分别与HR-RTECs共培养,BMSCs与RTECs共培养作为对照。培养48h后检测各组BMSCs的定向迁移能力,ELISA检测RTECs培养上清中基质细胞衍生因子1(SDF-1)浓度,Western印迹检测BMSCs内pAKT、pMAPK水平。构建AKI小鼠模型,随机分为BMSCs移植组、CXCR4-BMSCs移植组和null-BMSCs移植组,移植细胞均采用5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,移植7d后处死,免疫组化法检测移植细胞在肾组织的分布。结果:成功转染的BMSCs活力及分化潜能均无变化,CXCR4表达在CXCR4-BMSCs中明显增加。HR-RTECs模拟的AKI共培养环境可增强BMSCs的迁移能力,空载体转染对BMSCs的迁移能力并无额外影响,但CXCR4修饰的BMSCs向AKI微环境的迁移细胞数进一步显著增加。HR-RTECs培养上清中的SDF-1浓度增加,与其共培养的三种BMSCs内的pAKT、pMAPK水平也均增加,且以CXCR4-BMSCs的pAKT、pMAPK水平最强。CXCR4基因修饰可显著增加AKI肾组织中BrdU+细胞(BMSCs)的比例。结论:AKI微环境对BMSCs有明显趋化作用,CXCR4基因修饰可进一步增强BMSCs的定向迁移能力,SDF-1/CXCR4轴为发挥作用的主要趋化因子/受体,其下游的AKT和MAPK通路为发挥作用的可能信号机制。CXCR4-BMSCs移植有望成为修复AKI的一种新的有效方法。

淫羊藿苷对股骨骨折MSCs迁移及免疫功能影响

目的探讨淫羊藿苷对股骨骨折间充质干细胞(MSCs)迁移及免疫功能的影响。方法选取SPF级健康雄性SD大鼠96只,随机分为对照组16只及造模组80只。造模组通过截断股骨干中段建立股骨骨折模型,对照组予以假手术。将造模成功的大鼠随机分为模型组、骨肽组及淫羊藿苷低、中、高浓度组,各16只。模型组及对照组分别给予0.9%氯化钠注射液5 mL·kg^-1,日1次,腹腔注射;骨肽组给予复方骨肽注射液5 mL·kg^-1,日1次,腹腔注射;淫羊藿苷低、中、高浓度组分别给予8、16、24 mg·mL^-1的淫羊藿苷溶液5 mL·kg^-1,日1次,腹腔注射。各组大鼠均给药4周。检测比较各组骨折愈合Garrett评分、股骨骨体积(BV)、样本体积(TV)、骨体积分数(BVF)、MSCs迁移能力,以及外周血T淋巴细胞水平。结果与模型组比较,各组大鼠骨折愈合Garrett评分较高,股骨BV、TV、BVF较高,骨折端MSCs迁移能力较高,外周血CD4^+T淋巴细胞、CD4^+/CD8^+比值较高,且淫羊藿苷低浓度组<淫羊藿苷中浓度组、骨肽组<淫羊藿苷高浓度组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论淫羊藿苷能有效促进股骨骨折大鼠骨折愈合,其作用可能与提高MSCs迁移能力及细胞免疫功能有关,且药物浓度越高作用越好。

补阳还五汤通过调控PI3K/Akt、JAK2/STAT3信号促进BMSC趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠神经元活性及认知功能的影响

目的研究补阳还五汤通过调控磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、内源性酪氨酸激酶(JAK)2/信号传导和转录启动因子(STAT)3信号促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响。方法选取健康大鼠53只,随机分为健康组(健康大鼠常规饲养)、损伤组(建立脊髓损伤模型)、干预组(补阳还五汤治疗)、对照组(甲泼尼龙治疗),每组12只,剩余5只大鼠用于补阳还五汤含药血清制备。流式细胞术鉴定BMSCs细胞。Transwell小室法测大鼠BMSCs迁移。高架十字迷宫和Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能。苏木素-伊红(HE)染色检测脊髓组织病理形态。TUNEL测脊髓组织神经细胞凋亡。免疫组化检测p-JAK2、p-STAT3。Western印迹测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt。结果传代后的培养细胞呈旋窝状或放射状贴壁生长,细胞多呈星形、梭形或三角状,培养3代后,细胞贴壁加快、形态均一,呈旋窝状或单层放射状生长。培养细胞表面抗原CD29、CD90为阳性,CD31、CD45为阴性,提示其为BMSCs细胞。与健康组相比,损伤组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著降低,不同时间的潜伏期显著升高(P<0.05)。与损伤组相比,干预组与对照组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著升高,不同时间的潜伏期显著降低(P<0.05)。干预组与对照组各指标对比无统计学差异(P>0.05)。健康组脊髓组织结构完整。损伤组脊髓组织疏松水肿,有细胞空泡变性产生。相较于损伤组,干预组与对照组大鼠脊髓组织病理形态有所改善。与健康组相比,损伤组BMSCs、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt显著降低,神经细胞凋亡率、p-JAK2、p-STAT3显著升高(P<0.05)。与损伤组相比,干预组BMSCs、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt显著升高,神经细胞凋亡率、p-JAK2、p-STAT3显著降低(P<0.05)。干预组与对照组各指标水平无统计学差异(P>0.05)。结论补阳还五汤通过激活PI3K/Akt通路抑制JAK2/STAT3信号通路的激活,促进BMSCs的迁移,减轻神经细胞的凋亡,起到神经保护的作用,从而改善脊髓损伤大鼠的认知功能。