Wnt3a/β-catenin信号通路诱导人关节软骨间充质祖细胞增殖能力和向软骨分化的能力

目的研究Wnt3a/β-catenin信号通路对人关节软骨间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells,MPCs)老化的影响。方法 RT-PCR和Western blot检测正常人(对照组)和原发性骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者(OA组)MPCs中Wnt3a/β-catenin的表达。Western blot检测β-catenin在Wnt3a/β-catenin信号激活与阻断后细胞中的积累,MTT检测细胞的增殖情况,RT-PCR检测细胞向软骨细胞诱导后的分化情况。结果 OA组MPCs中Wnt3a和β-catenin蛋白表达明显高于对照组;在Wnt3a/β-catenin信号通路激活的对照组MPCs中β-catenin积累增加,阻断后β-catenin积累降低;Wnt3a/β-catenin信号通路激活的对照组MPCs增殖能力降低,阻断后增殖能力提高;Wnt3a/β-catenin信号通路激活的对照组MPCs向软骨细胞诱导分化后较对照组MPCs中Ⅱ型胶原、aggrecan、SOX9表达降低(P<0.01);Wnt3a/β-catenin信号通路激活的同时加入阻断剂,Ⅱ型胶原、aggrecan、SOX9表达有明显恢复(P<0.05);Wnt3a/β-catenin信号通路阻断组细胞与对照组MPCs组相比没有差异。结论 Wnt3a/β-catenin信号通路激活促进了MPCs老化,Wnt3a/β-catenin信号通路阻断能够抑制MPCs老化,Wnt3a/β-catenin在OA中可能发挥了重要作用。

小鼠间充质祖细胞向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的:体外培养C57小鼠密质骨碎片来源的间充质祖细胞(Mesenchymal progenitor cells,MPC),探讨MPC体外向神经元样细胞定向诱导分化的可行性。方法:取C57小鼠后肢长骨,剪成骨碎片,经Ⅱ型胶原酶消化后体外培养MPC,流式细胞术检测鉴定其免疫学表型。取生长良好的第三代MPC,神经元原代培养上清液定向诱导,对诱导后的MPC,以神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)及神经丝蛋白(Neurofilament protein,NF)为对照,应用免疫细胞化学染色法,检测神经元标志物的表达。结果:成功培养原代MPC,传代后生长良好,流式细胞术检测CD29、CD44组阳性率与其同型对照组相比有明显差异(P<0.05)。经神经元原代培养上清液诱导后,MPC可表达神经元特异性标志物NSE及NF。结论:从小鼠密质骨碎片分离培养出的间充质祖细胞获得率高,并可诱导分化为神经元样细胞。

SOX6和SOX9基因转染对人原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞增殖和成软骨分化的调控作用

目的观察SOX6和SOX9基因转染对原发性OA关节软骨MPCs的促增殖、分化作用,为通过调控关节软骨MPCs以防治原发性OA提供理论依据。方法分别以pAdTrack-CMV-SOX6、SOX9腺病毒穿梭质粒构建SOX6、SOX9基因,并感染原发性OA关节软骨MPCs,比较基因感染组和未感染组成软骨诱导分化后TB、Ⅱ型胶原以及Ⅱ型胶原mRNA表达的变化。结果SOX6和SOX9能够分别稳定感染OA关节软骨MPCs;经二者分别感染的关节软骨MPCs成软骨诱导分化后,其TB染色、Ⅱ型胶原染色呈强阳性表达,未基因感染细胞为弱阳性着色;SOX6基因感染原发性OA关节软骨MPCs的Ⅱ型胶原mRNA表达量为未基因感染细胞的3.8倍(P<0.01),SOX9基因为未感染细胞的5.15倍(P<0.01)。结论构建的SOX6、SOX9基因序列与基因库报道序列完全一致;SOX6和SOX9能稳定感染原发性OA关节软骨MPCs,并显著促进感染细胞成软骨分化;提示通过适宜浓度的bFGF、TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs的作用及SOX6和SOX9基因感染,可能具有促进原发性OA关节软骨损伤修复的作用。

胎儿心脏黏附细胞具有类似间充质祖细胞特征(英文)

为了观察人心脏是否含具有间充质祖细胞特性的细胞,从胎儿心脏分离、培养单个核细胞并从形态、表型和功能3个方面与骨髓间充质祖细胞进行比较和鉴定。结果表明,从心脏分离培养的细胞为成纤维样,表面抗原为CD73,CD105,CD29,CD44,HLA-ABC,CD166阳性,而CD45,CD34,CD86,HLA-DR阴性。在不同的分化体系中,细胞能分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。细胞扩增迅速,具有低免疫原性特性。结论从心脏分离培养的细胞具有间充质祖细胞特性。

人骨关节炎关节软骨间充质祖细胞的免疫磁珠分选和鉴定

背景:从骨关节炎关节软骨中分离培养软骨细胞,再用免疫磁珠分选技术从关节软骨中分选软骨祖细胞,并进行鉴定,经作者检索目前国内没有报道。目的:实验选取人工膝关节置换患者软骨组织体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,拟进一步验证在人软骨组织中含有间充质祖细胞。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-06/12在解放军第三军医大学毒理教研室及西南医院烧伤科实验室完成。材料:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(>3cm),患者对治疗及实验均知情同意。方法:统一选用原发性骨关节炎患者关节软骨标本,采用免疫磁珠法分选获得CD105/CD166阳性细胞。并进行成软骨和成脂诱导分化。主要观察指标:①免疫磁珠分选细胞用流式细胞仪和免疫组织化学检测,观察细胞生长特性。②分选细胞成骨和成脂分化后细胞形态和功能的变化。结果:①免疫磁珠分选的关节软骨间充质祖细胞原代和传代细胞均具有干细胞的生长特性。②分选的细胞免疫组织化学检测表达CD105和CD166阳性染色,流式细胞仪检测CD105和CD166阳性细胞比例分别为98.72%和97.5%。④分选细胞经成软骨、成脂诱导后能分化为具有相应细胞表型的细胞。结论:人关节软骨组织中存在具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从关节软骨细胞中分离出来。

神经断离处移植间充质祖细胞延缓骨骼肌萎缩

目的探讨间充质祖细胞(MPC)移植于神经断离处延缓失神经性骨骼肌萎缩。方法取GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPC培养及鉴定。选取C57小鼠36只,随机分为MPC移植组、神经断离组及对照组,MPC移植组坐骨神经断离处注入5μL MPC悬液,神经断离组注入等量PBS,对照组不作处理。观察小鼠后肢活动能力,术后2和4周测量腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率及观察超微结构,用Western blot检测α-actin、MHC及RT-PCR检测Myogenin、MyoD的表达。结果术后2和4周,MPC移植组腓肠肌湿重及肌纤维横截面积维持率显著高于神经断离组(P<0.05);术后4周,MPC移植组肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化程度明显低于神经断离组,α-actin、MHC、Myogenin、MyoD表达强度显著高于神经断离组(P<0.05)。结论异体间充质祖细胞体内移植可有效延缓失神经肌肉萎缩。

间充质祖细胞源性的神经元样细胞肌内移植后自身特性的维持

目的探讨间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells,MPCs)源性的神经元样细胞肌内移植后能否维持其自身特性。方法取3周龄健康GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPC培养及鉴定,选取生长良好的第3代MPC,采用神经元原代培养上清液进行神经元样细胞诱导分化后收集细胞,并制备成5×105/μL细胞悬液备用。选取12周龄健康C57小鼠24只,按随机数字表法分为损伤+移植细胞组、损伤+生理盐水组、假手术+移植细胞组、假手术+生理盐水组。损伤+移植细胞组及假手术+移植细胞组:将制备的5μL MPC悬液散点注入小鼠三头肌内;损伤+生理盐水组和假手术+生理盐水组:同法注入等量生理盐水。术后4周取材,荧光显微镜下观察肌内移植细胞存活情况,电镜观察肌肉超微结构的变化,免疫荧光染色检测神经元特异性标志物NSE、NeuN及神经胶质特异性标志物GFAP的表达情况。结果肌内移植细胞生长良好且均匀分布于肌细胞间隙,并抑制了肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的发生。损伤+移植细胞组定植存活的移植细胞阳性表达:NSE(58.35±1.37)%、NeuN(60.22±0.16)%及GFAP(13.32±1.65)%,损伤+生理盐水组、假手术+移植细胞组、假手术+生理盐水组均无阳性细胞表达。结论 MPC具有良好的生物学活性,经体外诱导分化为神经元及神经胶质样细胞后移植于失神经支配肌内可定植存活,并能够维持神经元及神经胶质样细胞的特性,同时有效抑制了肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的发生。

bFGF和TGF-β对原发性骨关节炎软骨间充质祖细胞增殖调控作用

目的观察bFGF和TGF—β1对原发性骨关节炎（OA）关节软骨间充质祖细胞（MPCs）的促增殖作用，为通过调控关节软骨MPCs以防治原发性OA提供理论依据。方法采用MTT法测定不同浓度bFGF和TGF—β1单独或联合作用下对原发性OA关节软骨MPCs的增殖作用。结果10．0-50．0ng／mL的bFGF、0．1～1．0ng／mL的TGF-β1单独作用于传代培养原发性OA关节软骨MPCs时，其培养细胞的增殖速率显著增加（P〈0．05），而随着二者浓度的进一步增加，其增殖速率无显著变化（P〉0．05）；bFGF10．0ng/mL＋TGF—β1 1．0ng／mL联合作用时，对原发性OA关节软骨MPCs具有明显促增殖作用（P〈0．05）。结论bFGF、TGF-β1对原发性OA关节软骨MPCs增殖具有重要作用，不同浓度的bFGF、TGF—β1及bFGF＋TGF-β1促增殖作用不同，提示通过适宜浓度的bFGF、TGF—β1对原发性OA关节软骨MPCs的作用，可能具有促进原发性OA关节软骨损伤修复的效果。

软骨多参数磁共振成像评估脂肪间充质祖细胞治疗膝骨关节炎效果的价值

目的·分析膝关节软骨多参数磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)在评估异体人源脂肪间充质祖细胞(human adipose-derived mesenchymal progenitor cells,haMPCs)治疗骨关节炎效果中的价值。方法·对22例膝骨关节炎受试者给予haMPCs治疗,根据给药剂量随机分为低、中和高3个剂量组。在治疗前及治疗后第48周分别对治疗膝关节进行西安大略大学和麦克马斯特大学骨关节炎指数(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index,WOMAC)评分和软骨多参数MRI扫描(3DSPGR、T2-mapping、T2^*-mapping、T1ρ-mapping和DWI),测量并记录治疗前后受试者WOMAC评分、软骨体积、T2值、T2^*值、T1ρ值与表现扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值,比较治疗前后及不同剂量组间这些评估指标的变化。结果·18例受试者完成了WOMAC评分及2次MRI检查。治疗后,除软骨体积外,所有受试者WOMAC评分、T2值、T2^*值、T1ρ值及ADC值与治疗前均存在显著差异(P<0.05)。各剂量组治疗前后比较显示:WOMAC评分、T2^*值及T1ρ值在3个剂量组均可见显著性改变(P<0.05);T2值在中、高剂量组可见显著性改变(P<0.05);ADC值仅在高剂量组发生显著变化(P=0.026);而软骨体积未见显著性变化(P>0.05)。进一步组间比较显示:治疗前各评估指标均无显著差异(P>0.05);治疗后仅高剂量组与低剂量组间受试者软骨T1ρ值存在显著差异(P=0.012)。结论·多参数软骨MRI组织成分成像可用于评估haMPCs治疗骨关节炎的效果,较软骨体积评估可能更敏感。

间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植延缓骨骼肌萎缩

目的 :探讨间充质祖细胞(Mesenchymal progenitor cell,MPC)源性神经元样细胞移植于靶肌肉内延缓失神经性骨骼肌萎缩。方法 :取GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPC培养、诱导及鉴定。选取C57小鼠36只,随机分为MPC移植组、神经断离组及对照组,MPC移植组腓肠肌内散点注入5μL MPC悬液,神经断离组腓肠肌对应部位散点注入等量PBS,对照组不作处理。观察小鼠后肢活动能力,术后2和4周测量腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率及观察超微结构,用Western blot检测α-actin、MHC及RT-PCR检测Myogenin。Myo D的表达。结果:术后2和4周,MPC移植组腓肠肌湿重及肌纤维横截面积维持率显著高于神经断离组(P<0.01);术后4周,MPC移植组肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化程度明显低于神经断离组,α-actin、MHC、Myogenin、Myo D表达强度显著高于神经断离组(P<0.01)。结论:异体间充质祖细胞靶肌肉内移植可有效延缓失神经肌肉萎缩,为临床上周围神经损伤后肌肉萎缩的防治提供了新的思路和方法。

人原发性骨关节炎与正常人关节软骨间充质祖细胞多向分化能力的对比研究

[目的]观察原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞的生长和增殖特性及其成软骨、成骨和成脂分化能力,探讨关节软骨间充质祖细胞在原发性骨关节炎发病中的重要作用。[方法]观察原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞成软骨(微团培养)诱导分化后的细胞形态变化,TB、Ⅱ型胶原、Aggrecan染色,GAG含量及Ⅱ型胶原mRNA表达;成骨(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,钙结节染色,ALP活性及BGPmRNA表达;成脂(单层传代培养)诱导分化后细胞形态变化,油红染色,油红染色阳性细胞比率及TG含量。[结果]原发性骨关节炎及正常人关节软骨间充质祖细胞成软骨诱导分化后细胞TB、Ⅱ型胶原、Aggrecan染色均呈阳性,原发性骨关节炎者GAG含量减少及Ⅱ型胶原mRNA表达减弱(P<0.05);成骨诱导分化后细胞钙结节染色均呈阳性,原发性骨关节炎者ALP含量减少及BGPmRNA表达减弱(P<0.05);成脂诱导分化后细胞油红染色均呈阳性,原发性骨关节炎者TG含量增加(P<0.05)。[结论]关节软骨间充质祖细胞经成软骨、成骨及成脂诱导后均能分化为具有相应功能细胞特性的分化细胞。原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞成软骨和成骨分化能力降低,而成脂分化能力增加,提示原发性骨关节炎关节软骨间充质祖细胞分化功能出现异常,骨关节炎关节软骨细胞对软骨损伤修复能力降低。

骨形态发生蛋白9促进小鼠颅骨间充质祖细胞成骨分化的实验研究

目的研究腺病毒载体介导的骨形态发生蛋白9(BMP-9)对小鼠永生化颅骨间充质祖细胞(i CAL)成骨分化的诱导作用。方法以i CAL为模型,设置绿色荧光蛋白(GFP)对照组和BMP-9诱导组,于诱导后的3、5、7 d对早期成骨分化指标碱性磷酸酶(ALP)活性进行定性和定量检测;于诱导后的14 d通过茜素红染色检测骨钙结节形成;荧光定量PCR法和Western印迹检测成骨细胞分化标志基因Runx2、OCN表达情况。结果 BMP-9诱导组细胞内ALP活性高于GFP对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);BMP-9诱导组形成较多的钙盐结节沉积;荧光定量PCR检测结果显示诱导组中Runx2、OCN的mRNA表达量明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05),Western印迹检测3 d Runx2蛋白表达上调,5 d OCN蛋白表达上调。结论 BMP-9促进小鼠永生化i CAL成骨分化。

人脐血间充质干/祖细胞诱导为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血间充质干细胞用于神经细胞再生的可行性与人脐血间充质干/祖细胞最佳的诱导培养条件。寻找一种合适的细胞来源进行移植以代替受损的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞来修复神经损伤。方法将脐血单个核细胞置于低血清(2%)达氏修正依氏培养基中培养,生成贴壁细胞层,依传代方法,用相同培养条件进行扩增,扩增后的贴壁细胞置入细胞培养液(加入新生大鼠神经细胞分离培养上清液)中,并添加表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行诱导分化。采用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测被诱导的神经样细胞的表面标志及细胞特异性标志、结构,并进行分析。结果脐血间充质干/祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为0.5×10-6,在传20代时,可有效扩增1.5×106倍,诱导后,70%的脐血间充质干/祖细胞分化为神经样细胞。结论采用上述扩增与诱导条件,脐血间充质干/祖细胞可得到有效扩增,并可高效向神经样细胞分化,从而证实脐血是一种细胞替代治疗前景光明的细胞来源。

人脐血间充质干/祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究

目的 了解脐血间充质干 /祖细胞用于心肌细胞再生的可行性 ,并探讨其最佳的诱导培养条件。方法 将脐血单个核细胞置于低血清 (2 % )DMEM培养基中生成贴壁细胞层 ,依传代方法 ,用相同培养条件进行扩增 ,扩增后的贴壁细胞置入心肌诱导培养液中 ,并添加 5 氮杂胞苷进行诱导分化、采用心肌特异性收缩蛋白 肌钙蛋白T染色鉴定被诱生的心肌样细胞。结果 脐血间充质干 /祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为 0 .5× 10 -6,在传 2 0代时 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍 ,诱导后 ,70 %的脐血间充质干 /祖细胞分化为心肌样细胞。结论 采用上述扩增与诱导条件 ,脐血间充质干 /祖细胞可得到有效扩增 ,并可高效向心肌样细胞分化。

人胚胎发育过程中间充质干祖细胞与造血细胞间的起源关系探讨

目的探讨人胚胎发育过程中间充质干祖细胞(MSPCs)与造血细胞间的起源关系。方法取发育不同时间药流胚胎,分离不同造血组织消化成单个细胞,于高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)培养体系培养10~14 d,倒置显微镜下挑取直径大于0.5 mm的HPP-CFC集落于液体培养体系进行二次培养,对二次培养中出现的贴壁细胞进行扩增并鉴定其细胞表面分子的表达,于不同分化体系鉴定其是否具有MSPCs的分化特性。结果本研究总结了胚胎发育不同时期主动脉-性腺-中肾(AGM)区、卵黄囊、胎肝等不同部位包括HPP-CFC在内的各类造血前体细胞的发育动态,发现从28体节开始,一定比例的AGM区HPP-CFC除能够分化产生造血细胞外,其来源的贴壁细胞具有MSPCs的分化功能,贴壁细胞在淋巴母细胞转化实验中可抑制T细胞的增殖。结论人胚胎AGM区内,部分MSPCs和造血细胞起源于共同前体。

5-氟尿嘧啶损伤骨髓血管周造血龛的机制

目的以体外分离小鼠骨髓血管周间充质祖细胞为研究对象,探讨5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对血管周造血龛的损伤及其机制。方法胶原酶消化分离提取C57BL/6J小鼠骨髓血管周间充质祖细胞,体外培养;琼脂糖凝胶电泳检测造血龛特异性基因表达,台盼蓝计数活细胞,CCK-8检测细胞增殖,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,酶学法检测丙二醛MDA和超氧化物歧化酶SOD水平,成骨成脂诱导分化和成骨相关基因qRT-PCR实验检测细胞成骨与成脂分化潜能,qRT-PCR检测造血因子基因表达。建立造血细胞与血管周间充质祖细胞共培养体系,进行基质细胞-造血细胞间黏附分子及信号分子检测,造血细胞活性、氧化还原指标以及β-半乳糖苷酶特异性细胞衰老检测。结果5-FU导致血管周间充质祖细胞同时发生凋亡和衰老,抑制细胞增殖,氧化应激导致细胞成骨/成脂分化失衡,下调造血因子SCF、CXCL12、G-CSF转录,减弱与造血细胞间VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA1黏附作用、削减TPO/MPL、Ang-1/Tie-2信号作用,导致造血细胞发生氧化应激,诱发细胞衰老。结论5-FU诱导血管周间充质祖细胞氧化损伤,间接引起造血细胞氧化应激性衰老。

肾髓同治方防治小鼠去卵巢绝经后骨质疏松症的机制

目的:研究肾髓同治方对小鼠去卵巢绝经后骨质疏松症的治疗作用及其潜在机制。方法:雌性C57BL/6J野生型小鼠18只,随机分为假手术组、模型组、肾髓同治组;间充质祖细胞β-catenin^(Gli1ER)敲除小鼠18只,随机分为阴性对照组、β-catenin^(Gli1ER)组和β-catenin^(Gli1ER)+肾髓同治组。双侧卵巢切除法造绝经后骨质疏松症模型。灌胃8周后,Micro-CT观察股骨微结构变化,ABH染色观察组织病理学变化,实时荧光定量PCR法检测β-catenin、PPAR-γ、Osterix mRNA表达水平。结果:C57BL/6J小鼠中,与模型组比较,肾髓同治组小鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量显著提高(P<0.05),骨小梁面积显著增大(P<0.05),脂滴面积和直径显著减小(P<0.05),骨小梁分离度显著降低(P<0.05);肾髓同治方干预后显著提高β-catenin、Osterix mRNA表达水平(P<0.05),降低PPAR-γmRNA表达水平(P<0.01)。β-catenin^(Gli1ER)敲除小鼠中,与阴性对照组比较,β-catenin^(Gli1ER)组的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量显著降低(P<0.05),骨小梁面积显著减小(P<0.05),骨小梁分离度显著提高(P<0.01),脂滴面积和脂滴直径显著增大(P<0.05),β-catenin^(Gli1ER)组与β-catenin^(Gli1ER)+肾髓同治组的指标差异均无统计学意义。结论:肾髓同治方对小鼠去卵巢绝经后骨质疏松症有一定的防治作用,其主要机制与调控间充质祖细胞Wnt/β-catenin信号通路有关。