地被菊间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系的研究

采用三步培养法建立了地被菊花品种‘玉人面’间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系。试验以地被菊花品种‘玉人面’茎段(节间)为外植体,研究了生长调节剂、光照强度等因子对其间接体细胞胚诱导和分化的影响,同时进行了抗生素敏感性试验。结果表明:胚性愈伤组织诱导培养基为MS+KT2.0 mg.L-1+2,4-D 2.0 mg.L-1+NAA0.5 mg.L-1,诱导15 d后,将获得的黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织转入胚性愈伤组织分化培养基MS+KT2.0 mg.L-1+2,4-D 1.0 mg.L-1+NAA0.5 mg.L-1中,诱导15 d后再转入MS+KT2.0 mg.L-1+NAA0.5 mg.L-1的分化培养基中培养20 d,光照强度为1 000～2 000 lx,胚性愈伤组织诱导率、分化率分别为95.3%、92.7%,平均每个外植体分化的芽数为17.8个,获得的再生芽的稳定性为99.5%。抗生素敏感性试验表明:地被菊花品种‘玉人面’间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系中,卡那霉素选择压为20 mg.L-1;头孢霉素在胚性愈伤组织诱导时的选择压为300 mg.L-1,在胚性愈伤组织分化培养时选择压为100 mg.L-1。

怀黄菊间接体胚受体再生体系的建立及CmTGA1的遗传转化

植物受体再生及遗传转化体系的建立是对植物进行转基因操作时至关重要的一个技术环节。以菊花优良种质怀黄菊(Chrysanthemum morifolium cv.‘Huaihuang’)为试材,探讨胚状体诱导所需的最佳培养基及芽分化和根生长的最适抗生素选择压。在此基础上,将抗病基因Cm TGA1通过同源转化的方法转入怀黄菊,获得再生植株。结果表明,在附加1.5 mg·L-1IAA、0.5 mg·L-1 6-BA和1.0 mg·L-1 2,4-D的MS培养基上诱导培养15天后,再去除2,4-D进行分生培养,并进一步诱导芽再生,最终86%的供试外植体通过胚状体途径获得再生芽;在芽分化时所需潮霉素选择压为5.0 mg·L-1,生根时潮霉素选择压为4.5 mg·L-1。对转化植株进行半定量PCR(semi-quantitative PCR)和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)检测,结果表明,Cm TGA1基因成功整合到转化植株基因组中,从而建立了怀黄菊间接体细胞胚途径转基因受体再生体系。该技术的建立为通过转基因手段解决生产中存在的怀黄菊病害感染严重和种质退化等问题奠定了基础。