融合免疫荧光技术的共聚焦显微镜实验教学实践

为了建立完整的科研实验技能学习体系,构建了高效可行的实验教学课程,并对近年开展的激光扫描共聚焦显微镜技术实验教学课程内容和方法进行了优化和实践。课程将科学理论与实验技能有机结合,把间接免疫荧光技术融合到共聚焦显微镜实验教学中,克服大型成像仪器教学中时间和空间限制。该教学课程帮助学生掌握共聚焦显微镜技术原理、应用和实验方法,提高学生们的实验动手能力和科研素养。

利用间接免疫荧光染色和协同凝集技术检测梨火疫病菌

提取梨火疫病菌 (0 0 5 6菌株 )的脂多糖免疫家兔 ,获得抗血清 ,建立了检测梨火疫病菌的间接免疫荧光染色和协同凝集检测技术 ,对梨火疫病菌的不同菌株和人工接种发病样品实施了检测。结果表明 ,这 2种方法可以准确、灵敏地检测梨火疫病菌及样品 ,方法简单、快速、实用 ,可以在中国口岸推广使用 ,减少梨火疫病进入中国的风险。

间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌

建立了凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌的间接免疫荧光抗体检测方法。确定免疫血清和荧光抗体的最适工作浓度分别为1∶1000和1∶200;交叉反应和阻断试验表明该方法具有较高的特异性。用该方法检测了10份人工感染后发病的凡纳滨对虾和10份感染后外观健康的凡纳滨对虾,阳性检出率分别为100%和60%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义,而且该方法具有快速、特异、简单的优点,适合于现场应用推广。

应用间接免疫荧光抗体技术检测鸡传染性贫血病毒抗体

用 MDCC－ MSB1细胞增殖鸡传染性贫血病毒 (CAV)CuX－ 1毒株制备抗原，建立了检测 CAV抗体的间接免疫荧光的方法。应用该方法检测 CAV基因工程亚单位苗首免、二免和三免后鸡体内的 CAV抗体，结果表明首免一个月后，鸡血清中 CAV抗体的滴度很低或几乎测不到抗体；二免一个月后，鸡血清中可测到较高的 CAV抗体；三免一个月后，鸡血清中的 CAV抗体滴度更高。另外，应用此方法调查了某禽场 3个批次鸡体内的 CAV抗体，其中 32日龄黄鸡和 1日龄乌骨鸡体内的 CAV抗体为阴性，而 1日龄黄鸡体内的 CAV抗体为阳性。

利用PCR和间接免疫荧光染色技术检测风信子黄腐病菌

根据风信子黄腐病菌(Xanthom onas hyacinthi,XHA)的fimA基因,合成了1对特异性引物JAAN/JARA,目的片段为226 bp,用来检测样本中有无目标细菌。用XHA全菌体免疫家兔,获得抗血清,建立了检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色检测技术。用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测。结果表明,这两种方法可以准确、灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品,方法简单、快速、实用,可以在口岸检疫中推广使用,以减少风信子黄腐病菌进入中国的风险。

间接免疫荧光技术研究黄芪多糖体外抗新城疫病毒作用

为探究间接免疫荧光技术辅以MTT法研究黄芪多糖(APS)抗新城疫病毒(NDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)作用的可行性。将安全浓度范围内不同浓度APS和NDV以预防和治疗两种方式加入CEF培养体系中,MTT法测定CEF活力,间接免疫荧光技术检测NDV增殖情况。结果显示预防组CEF增殖活力强于治疗组,治疗组NDV的增殖量较预防组大,P<0.05或P<0.01。表明间接免疫荧光技术能直观的反应病毒在细胞上的增殖情况,该技术联合MTT法研究中药抗病毒作用可靠、可行。

间接免疫荧光技术检测尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒

目的:间接免疫荧光技术在临床与基础研究中的应用较为广泛,但却极少有人用于尖锐湿疣的检测,我们旨在验证该方法是否可行,并将之与PCR方法相比较,以了解其准确性和敏感性。材料和方法:60例临床确诊的尖锐湿疣疣体标本均取自性病门诊。采取疣体印片,用小鼠抗人的HPV6型作为Ⅰ抗,FTTC标记的山羊抗鼠IgG作为Ⅱ抗,在荧光显微镜下检查。剩余标本消化后做PCR,证实有无人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的DNA,并用RFLP方法进行分型。结果:在34例尖锐湿疣标本中检测到特异性荧光,阳性率为56.67%,而用PCR方法共检测到58例阳性,阳性率为96.67%。用X^2检验比较二者的阳性率,P<0.01。主要感染类型为6和11型,占98.28%。结论:间接免疫荧光技术针对的是乳头瘤HPV的衣壳蛋白,能检测有完整衣壳的成熟HPV,操作简便,有望用于宫颈涂片的常规检查,以筛查带HPV者,对预防宫颈癌提供帮助。但敏感性不及PCR技术。

细胞滴片间接免疫荧光实验技术的探讨

目的:探讨在有限条件下简化细胞滴片间接免疫荧光实验操作技术。方法:以大鼠胸腺细胞为抗原,兔抗鼠抗血清为一抗,FITC羊抗兔IgG荧光抗体为二抗做细胞滴片的间接免疫荧光染色,荧光显微镜观察结果。结果:细胞悬液浓度在105～106个/ml为宜,新鲜细胞固定后可长期保存备用,冻存细胞则不能使用;固定剂可选10%甲醛、甲醇等,也可不用固定剂;粘片剂也可不用;平整的试管架代替湿盒更方便。结论:细胞滴片的间接免疫荧光实验操作步骤可简化,以减少实验开支。

双重免疫荧光标记及激光共聚焦显微镜技术对不稳定膀胱逼尿肌间隙连接蛋白43的定量和定位实验

目的:建立一种应用荧光免疫组织化学双重标记技术和激光扫描共聚焦显微镜观察不稳定膀胱逼尿肌连接蛋白43表达和分布模式的方法。方法:实验于2003-09/2004-06在汕头大学医学院病理实验室完成。选择健康清洁级wistar大鼠50只,随机分成两组,对照组10只,不稳定膀胱组40只。建立膀胱出口梗阻模型之后行充盈性膀胱测压,确定不稳定膀胱组13只。对照组只行尿道分离术而不作结扎术。麻醉未醒即处死大鼠,取下膀胱分离出逼尿肌组织。①荧光免疫组织化学双重标记:应用罗丹明麦芽凝集素标记逼尿肌肌细胞膜,异硫氰酸荧光素素标记间隙连接蛋白43。②激光共聚焦显微镜技术:使用ACAS/Ultima312型激光共聚焦显微镜的检测器1和检测器2同时分别检测连接蛋白43和细胞膜(当只开通检测通道1时,仅显示代表连接蛋白43的绿色小短杆状或小点状荧光斑;当仅开通检测通道2时,仅显示被染成红色的细胞膜,清楚地显示了细胞的外形轮廓,胞浆及胞核则不显示;当两个通道同时开通时,绿色的连接蛋白43与红色细胞膜重叠后变成黄色)。主要参数如下:小孔孔径225μm,X轴扫描点数390,Y轴扫描点数390,扫描步径0.6μm,镜扫描速度10mm/s,扫描强度85%,激光强度360mW,每点采样次数30,物镜40倍,检测器1(最适波长488nm)灵敏度62%,检测器2(最适波长514nm),灵敏度58%。③激光共聚焦显微镜图像分析法:应用ImageAnalysis程序进行图像分析。以连接蛋白43的像素值占总像素值的百分比值作为连接蛋白43的像素密度,其大小代表连接蛋白43量的大小;以连接蛋白43荧光斑面积的大小反映连接蛋白43量的大小。结果:不稳定膀胱组中出现不稳定膀胱的13只和对照组10只进入结果分析。①两组大鼠逼尿肌连接蛋白43的像素密度和荧光斑面积比较:不稳定膀胱组连接蛋白43象素密度值较对照组象素密度值明显增多(3.45±1.58,0.85±0.44,t=5.037,P<0.01);不稳定膀胱组荧光斑面积较对照组显著增大犤(19.92±8.61)μm2,(11.46±2.55)μm2,t=2.995,P<0.01犦。②激光共聚焦显微镜下双重标记的大鼠逼尿肌连接蛋白43荧光图像:对照组逼尿肌肌束细胞平行排列,分布均匀,连接蛋白43表达量极少。不稳定膀胱组细胞大小不一,形状多样,排列紊乱,连接蛋白43数量较对照组明显增多,表现在密度增大,荧光斑面积增大,连接蛋白43的表达主要出现在细胞与细胞连接处。结论:采用双重标记的荧光免疫组织化学和激光共聚焦显微镜技术,抗连接蛋白43单克隆抗体特异地与间隙连接蛋白43结合,在组织原位上准确地标记间隙连接,同时显示细胞膜,既能对其进行定量分析,又能同时对其进行定位。

正常人皮肤用于间接免疫荧光技术检测寻常型天疱疮抗体的研究

目的:评价以人皮肤为底物的间接免疫荧光技术用于检测寻常型天疱疮抗体的方法。方法:用间接免疫荧光技术检测20例天疱疮患者和20例健康对照患者血清中的抗桥粒抗体,分别以人皮肤和猴食管为底物,并比较两种底物敏感性的差异。结果:以人皮肤作底物检测的阳性结果为19例(95.0%),以猴食管作底物检测的阳性结果为20例(100.0%)。对照组血清的检测结果均为阴性。人皮肤与猴食管上皮作底物的两种间接免疫荧光技术检测方法的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:以人皮肤为底物的间接免疫荧光技术可以作为一种检测寻常型天疱疮抗桥粒抗体的方法。

多重间接免疫荧光技术的建立及其在肝癌样本多种抗原检测中的应用

目的建立一种适合在肝癌组织同一冰冻切片上同时检测多种蛋白的多重间接免疫荧光染色法。方法用间接免疫荧光法联合激光扫描共聚焦显微镜技术对肝癌组织第一组4种蛋白进行染色和图像采集;用同源种属Ig G Fab抗体封闭;联合化学试剂(β巯基乙醇/十二烷基苯磺酸钠/盐酸胍/氢硼酸钠)清除法洗脱染料和抗体;再次对第二组4种蛋白进行染色和成像;用软件叠加两轮图像染色结果。结果激光光谱分离技术可以实现多达8种蛋白的共染结果;Ig G Fab抗体可以封闭非特异性染色;联合化学合剂清除第一轮抗体后,可在同一切片中进行第二轮染色。结论成功建立了在同一肿瘤组织标本同时检测多重标志物的方法。

应用间接免疫荧光技术检测家犬唾液中的狂犬病毒抗原的研究

本文报告在国内首次采用间接免疫荧光技术(IFA)检测外观“健康”带毒犬唾液中狂犬病毒抗原的研究探讨。结果显示,IFA法与现行敏感,特异和快速的酶联免疫吸附试验(ELISA)法在检测犬唾液中狂犬病毒抗原比较上,具有良好的一致性,IFA法不但具有简便、快速、特异等特点,而且还具有重复性好和不受被检标本少,造成试剂浪费而使试验费用增高的优点,是目前对狂犬、“健康”带毒犬、健康犬简便、敏感、特异和快速的鉴别方法。本方法的建立,在狂犬病传染源的监测与控制,预防狂犬病的发生和流行有极其重要的实用价值,适应于广大基层防病单位推广应用。

猪圆环病毒间接免疫荧光方法的建立

将接种PCV2且经多次传代的PK-15带毒细胞分散到96孔细胞培养板上,制成抗原诊断板,应用间接免疫荧光技术检测血清中PCV2的抗体。通过对各种反应物的工作浓度与作用时间的优化,建立了PCV2抗体的间接免疫荧光检测技术,可用于PCV2抗体水平的监测,为今后的猪圆环病毒疫苗抗体检测的研究提供了检测方法。

间接免疫荧光技术在免疫检验实验教学中的应用

免疫荧光技术是免疫学检验实验课程的经典教学内容,实验所需材料和方法多为教学用试剂盒提供。为了提高实验教学的效果,将科研实验中的间接免疫荧光技术应用到该教学中。从制备标本开始,整个实验过程均通过学生自己动手进行操作完成。在实验过程中利用兔抗人白介素6的多克隆抗体和荧光标记的山羊抗兔的二抗对人胶质瘤细胞进行标记和观察。通过让学生掌握科研中常用的间接免疫荧光标记技术,有助于提高学生的动手能力并逐步培养其科研综合素质。

猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立

目的猪鼻支原体是临床猪场的常见病菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤有明显相关性,但其致病机理有待深入,其感染细胞机制的研究尚未明确,因此,本研究欲建立一种用间接免疫荧光技术检测猪鼻支原体黏附宿主细胞的方法。方法以猪鼻支原体和猪肾上皮细胞为研究对象,以兔抗猪鼻支原体纯化抗体为一抗,以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立猪鼻支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法(IFA)。结果最终确定最小黏附滴度为1∶107 CCU/mL,猪鼻支原体黏附PK15所需时间为6h以上,一抗的最佳工作浓度为1∶100,二抗的最佳工作浓度为1∶1 600。结论表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪鼻支原体对宿主细胞的黏附作用。为猪鼻支原体的研究特别是感染细胞机制的体外研究提供基础方法,同时为疾病的诊断及疫苗的研发奠定基础。

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法联合检测抗核抗体在系统性红斑狼疮诊断中的意义

目的分析以间接免疫荧光法(IIF)法筛查的抗核抗体谱(ANAs)、抗双链DNA(dsDNA)抗体结果与线性免疫印迹法(LIA)检测ANAs的结果,了解2种方法是否可以相互取代及其联合检测的意义。方法 230例临床送检样本同时采用2种方法检测ANAs、抗dsDNA抗体与ANAs特异性抗体,分析检测结果的相互关系并寻找对临床有价值的检测方法。结果 2种方法检测结果总体符合率为57.0%;IIF(-)/LIA(+)患者中最易漏检的抗体为抗SSA抗体、Ro52、Jo-1、线粒体(AMA)-M2抗体。IIF(+)/LIA(-)中系统性红斑狼疮(SLE)组与非自身免疫病(AID)组在各个滴度间比较,差异均有统计学意义。检测抗dsDNA抗体,绿蝇短膜虫抗原片(CL)-IIF法的特异性和敏感性都超过了LIA法。SLE患者单一检测IIF-ANA敏感性较高,而LIA-ANAs特异性较高。2种方法联合诊断,敏感性提高。结论无论单独使用哪种检测方法都可能出现漏检的情况。2种方法不能互相代替,需同步检查。CL-IIF法检测抗dsDNA抗体的结果较LIA法更理想。

基因C型鸭甲肝病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

为建立基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)间接免疫荧光检测技术(IFA),本研究以纯化的DHAV-C单克隆抗体(MAb)为一抗,FITC标记的兔抗鼠Ig G(Ig G-FITC)为二抗,建立了DHAV-C IFA检测方法。该方法仅对感染DHAV-C的肝组织触片检测为阳性,而对分别感染基因A型鸭甲肝病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭源金黄色葡萄球菌、鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的SPF鸭肝组织触片检测为阴性,表明该方法特异性好;重复性试验表明,该方法批内和批间重复性好。一抗和二抗在-20℃至少能保存7个月。实验感染SPF雏鸭IFA和RT-PCR检测符合率100%。本研究建立的DHAV-C IFA方法特异性好,可以用于该病毒感染肝组织的快速检测。

被动凝集法、间接免疫荧光法和胶体金法联合检测肺炎支原体抗体对儿童肺炎支原体感染的诊断价值

目的分析被动凝集法(PA)、间接免疫荧光法(IFA)和胶体金法(GICT)联合检测对儿童肺炎支原体(MP)感染的诊断价值。方法选取进行MP抗体检测的患儿617例,以临床诊断为判断标准,分为MP感染组(345例)和非MP感染组(272例)。所有患儿均经PA检测MP总抗体,经IFA和GICT检测MP-IgM抗体。分析PA、IFA和GICT这3种方法单独检测及两两联合检测与临床诊断的一致性,受试者工作特征(ROC)曲线评价其对MP感染的诊断价值,分析PA联合IFA检测2组患儿抗体情况。结果MP感染组PA检测MP总抗体、IFA和GICT检测MP-IgM抗体的阳性率较非MP感染组高(P<0.01)。PA检测MP总抗体的阳性检出率高于IFA和GICT检测MP-IgM抗体的阳性检出率(P<0.01)。PA联合IFA与临床诊断为中度一致(Kappa值=0.41,P<0.05)。3种方法单独检测和两两组合检测中PA联合IFA的曲线下面积、敏感度、总符合率、阴性预测值最高,阴性似然比最低。GICT单独检测特异度最高。IFA单独检测阳性预测值和阳性似然比最高。当MP-IgM抗体阳性时,MP感染组23.44%的患儿总抗体滴度<1︰160,非MP感染组47.22%的患儿总抗体滴度≥1︰160。当MP-IgM抗体阴性时,MP感染组91.91%的患儿MP总抗体滴度≥1︰160,非MP感染组有73.50%的患儿总抗体滴度<1︰160。结论PA和IFA联合检测可为临床诊断儿童MP感染提供更客观、准确的检测结果。