鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

为建立鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒(MDV HVT)的间接免疫荧光方法,将MDV HVT病毒接种96孔细胞板培养(CEF),72 h后用鸡抗马立克氏病病毒阳性血清作为一抗和兔抗鸡荧光抗体作为二抗,对反应条件进行优化,建立了间接免疫荧光方法(IFA)。并与经典的马立克蚀斑计数方法进行病毒滴度的测定比较,运用统计学方法分析,P小于0.05,相关系数为0.995,说明两种方法相关性很好,两种方法均可用于马立克氏病病毒的滴度测定。IFA方法较蚀斑计数方法操作简便快捷,可代替蚀斑计数方法用于马立克氏病活疫苗的病毒含量的初步测定,同时为2025年版《中国兽药典》马立克氏病活疫苗增加IFA鉴别检验方法积累实验数据。

牦牛肠道病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

为了建立准确、快速的牦牛肠道病毒(yak enterovirus)检测方法,利用本实验室已获得的一株牦牛肠道病毒SWUN-AB001,免疫健康兔获得抗SWUN-AB001高免血清,建立了一种检测牦牛肠道病毒的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并对其工作条件和时间进行筛选,优化出最佳条件。采用该方法对40份临床腹泻样本进行了牦牛肠道病毒的检测,并与RT-PCR的检测结果进行比较。结果表明:获得的高免血清在该IFA方法中的最佳稀释度为1∶100,工作时间为30min;FITC标记的羊抗兔IgG(二抗)的稀释度为1∶800,工作时间为45min,牦牛肠道病毒特异性亮绿色荧光颗粒清晰可见;同时与牛病毒性腹泻病毒、轮状病毒、大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌和空肠弯曲杆菌反应均未见明显的荧光颗粒;该方法能够检测SWUN-AB001病毒的最低浓度约为20TCID50·mL-1;该方法的临床检测结果与RT-PCR的检测结果之间无差异(P=0.329)。结果表明该方法特异性强、重复性好、灵敏度高,为该病毒在牦牛养殖地区的流行病学调查、临床诊断和快速诊断试剂的开发奠定了基础。

犬腺病毒间接免疫荧光检测方法的建立

用犬腺病毒制作的抗原玻片,通过确定最佳一抗和荧光抗体浓度,特异性试验和敏感性试验,建立了犬腺病毒间接免疫荧光方法,可用于狐狸脑炎的诊断。

小鼠肠道RegⅢγ蛋白间接免疫荧光检测方法的建立

为了建立肠道RegⅢγ蛋白免疫荧光检测方法,试验探索及优化不同柠檬酸缓冲液抗原热修复时间,一抗、二抗浓度,建立间接免疫荧光检测小鼠肠道RegⅢγ方法。结果表明:抗原修复最佳时间为15 min,一抗、二抗最适稀释度分别为1∶500,1∶300。说明此方法针对RegⅢγ蛋白检测具有特异性强、组织破坏率低、荧光效果好的特点,可为RegⅢγ蛋白在肠道中的定位和动态分布提供有效试验检测条件。

狂犬病病毒HepFlury株P蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

本研究以原核表达的融合型的重组蛋白pET32a（＋）-P（狂犬病病毒HepFlury株P蛋白）免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,取脾细胞和SP2/0按常规杂交瘤技术进行细胞融合,经间接免疫荧光方法（IFA）筛选及对mAb进行初步鉴定。经3次亚克隆后获得1株稳定分泌表达的杂交瘤细胞株5G8。

弓形虫GRA1蛋白单克隆抗体的制备与间接免疫荧光检测方法的建立

本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体,用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板,设计引物扩增GRA1基因片段,构建原核表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明:成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白GRA1为可溶性表达,分子量约为27 kDa;Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别,表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株,分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6,并对它们进行亚型鉴定,其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1,1-B10、6-E6为IgM;IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性;建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h,FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法,并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测,结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测,有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。

抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用

为建立检测猪捷申病毒(PTV)抗体的方法,本研究利用PTV-8 Jilin/2003株为抗原,建立了检测PTV抗体的的间接免疫荧光技术(IFA)方法。该方法工作浓度分别是:一抗最适稀释度为1∶10;FITC标记二抗最适稀释度为1∶100;二抗中伊文氏兰最适稀释度为1∶30 000。敏感性试验、特异性试验表明该抗原板可以检出包含PTV-8型和1型在内的的所有PTV阳性血清,方法敏感、特异。与SN符合率94.0%。用该方法对黑龙江、山东、天津和河南等地的1 500份临床血清样品进行检测,阳性检出率为55.8%,表明我国猪群中PTV的感染已经非常普遍。该方法做为PTV的血清学诊断新技术,为开展PTV分子流行病学调查奠定了基础。

新布尼亚病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与应用

新布尼亚病毒是一种全新的病毒，基因组由L、M、S3个单负链RNA片段组成，现归属于布尼亚病毒科白蛉病毒属第三组病毒，与白蛉病毒属的乌库尼米病毒有最高的同源性（核酸的同源性38．83％，氨基酸的同源性28．57％）。新布尼亚病毒被证实是发热伴血小板减少综合征（fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）的重要病原，该病毒感染所致疾病有较高的病死率。在我国湖北、安徽、河南、山东、

鸡组织中禽波氏杆菌间接免疫荧光组化定位检测方法的建立

为研究禽波氏杆菌感染鸡后在体内组织器官中的定植规律及其在不同组织细胞中的定位、定量状况,本试验对禽波氏杆菌感染鸡组织器官的固定剂进行了筛选,制备石蜡切片,选择良好的粘片剂,利用纯化的兔抗禽波氏杆菌外膜蛋白IgG作为一抗,建立了能进行禽波氏杆菌抗原定位检测的间接免疫荧光组化法,并对禽波氏杆菌人工感染鸡进行了检测。经多次优化,确定将10%中性福尔马林作为固定剂固定组织24h,0.1%多聚-L-赖氨酸作为切片的粘片剂。最佳工作条件为2%脱脂奶粉37℃封闭30min;兔抗禽波氏杆菌外膜蛋白IgG 1∶100稀释,4℃孵育过夜;荧光素标记羊抗兔二抗1∶20稀释,37℃作用30min。该方法重复性和特异性检测良好,对禽波氏杆菌感染雏鸡组织器官的检测结果表明,该法能特异性地对鸡组织器官中的禽波氏杆菌进行抗原定位,气管、肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏中的禽波氏杆菌抗原均呈现特异性荧光信号,同细菌分离鉴定方法检测的阳性符合率为99.27%。试验结果表明,本试验所建立的间接免疫荧光组化法可作为一种有效的检测方法用于禽波氏杆菌致病机制的研究。

间接免疫荧光方法快速检测番鸭呼肠孤病毒病

本研究应用具有免疫荧光特性的抗番鸭呼肠孤病毒病单克隆抗体(MDRV 237-11)建立了检测番鸭呼肠孤病毒病抗原的间接免疫荧光(Mab-IFA)方法。结果显示人工感染MDRVMW9710株病毒后发病和死亡番鸭组织切片均可检出阳性病灶;且组织匀浆经尿囊腔途径接种12日龄番鸭胚,取死亡胚心制作冰冻切片进行IFA鉴定呈阳性结果。表明该方法特异性好、可用于快速检测番鸭呼肠孤病毒病。

间接免疫荧光染色检测幽门螺旋杆菌的方法及对比研究

自从1983年Marshall等从胃粘膜中分离出幽门螺杆菌(Helilobouter pylors,HP)以来,HP与胃炎、胃溃疡及胃部肿瘤的关系日益受到人们的重视,并建立了许多检测方法,但目前所用的方法多数需要作胃镜检查和采取胃粘膜,致使病人痛苦大,操作繁锁。

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮的诊断分析

进一步评估并观察间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮的诊断价值与意义。方法 本次研究中将2022年1月~2022年12月期间我院门诊、住院申请双抗链DNA抗体滴度检测的标本共计230例作为研究对象。最终确诊为系统性红斑狼疮患者共计95例,确诊为其他非自身免疫性疾病患者共计135例。分别应用间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮进行诊断,对诊断结果进行观察与分析。结果 间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阳性患者共94例,占比为40.90%;间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阴性患者共57例,占比为24.80%;间接免疫荧光法检出阴性/线性免疫印迹法检出阴性患者共42例,占比为18.3%。总符合率方面,阳性结果符合率为69.10%,阴性结果符合率为39.40%。对于诊断为系统性红斑狼疮患者而言,95例患者中,间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阴性患者共17例,间接免疫荧光法检出阴性/线性免疫印迹法检出阳性患者共1例。滴度1:100时,非自身免疫疾病组高于系统性红斑狼疮组,另2组滴度系统性红斑狼疮组高于非自身免疫疾病组;在各个滴度间进行对比,组间差异显著且存在统计学意义。结论 在系统性红斑狼疮临床诊断中,单独进行间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测均存在漏检的可能性,两种方法具有独特优势,不能相互替代。考虑两种方法检测符合率偏低的问题,可以尝试联合同步检测,以面向抗核抗体检测提供可靠结果,配合间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测的联合应用,使临床检测结果更为理想。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。

间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立

【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min后,以10%马血清37℃下封闭30min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈"334"分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。

猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)直观、特异和快速的检测方法,将TGEV接种PK-15细胞后,以抗TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,荧光素FITC标记的山羊抗小鼠Ig G为二抗,建立了TGEV的间接免疫荧光(IFA)检测方法。结果显示,TGEV的最佳接种效价为1×102TCID50,培养时间为24 h,细胞最佳固定液为40 m L/L多聚甲醛,最佳封闭条件为10 g/L BSA 37℃封闭30 min,一抗的最佳使用浓度为1 ng/L,二抗的最佳稀释度为1∶100。对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性。结果表明,建立的检测方法对TGEV具有良好的特异性。本研究建立的方法为TGEV的实验室诊断及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的检测手段。

用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律

用鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CHv强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、食道、十二指肠、胰腺、法氏囊和脑组织,制作切片,应用间接免疫荧光染色法(IFA)检测DEV在鸭体内的侵染过程和分布规律。结果显示:感染后4 h可在脾脏、胸腺和法氏囊中检测到DEV抗原;感染后6 h可在肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏检测到DEV抗原;IFA对各组织器官中DEV的平均检出率为肝脏46/50、脾脏48/50、肺脏46/50、肾脏0/50、肠道46/50、法氏囊46/50、胸腺47/50、胰腺0/50、大脑0/50、食道44/50、心脏0/50。研究表明:在急性病例中,脾脏、法氏囊、胸腺、食道、肠道、肝脏和肺脏为DEV的主要靶器官;接种后,病毒首先在脾脏、胸腺、法氏囊中出现,然后病毒迅速传播到肝脏、消化道和肺脏中;IFA检测石蜡切片中DEV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的较好方法。

利用间接免疫荧光染色和协同凝集技术检测梨火疫病菌

提取梨火疫病菌 (0 0 5 6菌株 )的脂多糖免疫家兔 ,获得抗血清 ,建立了检测梨火疫病菌的间接免疫荧光染色和协同凝集检测技术 ,对梨火疫病菌的不同菌株和人工接种发病样品实施了检测。结果表明 ,这 2种方法可以准确、灵敏地检测梨火疫病菌及样品 ,方法简单、快速、实用 ,可以在中国口岸推广使用 ,减少梨火疫病进入中国的风险。

间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位

差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化鸭病毒性肠炎病毒(DEV)免疫兔制备兔抗DEV高免血清后,用DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化的兔抗DEVIgG建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中DEV的方法。IFA的最佳条件为:石蜡切片用10mmol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液为微波修复液微波修复10min,胰酶修复20min;10%小牛血清室温封闭30min;加入1∶25的兔抗DEVIgG于4℃孵育过夜;再加入FITC标记的羊抗兔IgG于37℃孵育45min。以建立的IFA对DEV人工皮下感染死亡鸭的各组织器官进行检测,在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏中检测到DEV抗原。研究表明,IFA检测石蜡切片中的DEV具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的良好方法。