纳米抗体多聚化测略提升间接竞争性酶联免疫吸附实验检测黄曲霉毒素M_(1)的灵敏度

酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具有高通量、操作简单、检测结果明显等优点,是一种较为理想的检测食品中真菌污染物的免疫分析技术。然而,传统的ELISA方法具有较大的局限性,比如使用时抗体易受温度影响,容易变性,贮存期短,易受到检测环境中其他物质干扰而造成假阳性或假阴性等。该实验使用实验室前期获得的抗黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))纳米抗体(nanobody-M4,Nb-M4)与C4结合蛋白(recombinant C4 binding protein alpha,C4BPa)C端片段融合形成自组装七聚体融合蛋白(Nb-M4-C4 bpα),并基于该七聚体开发应用于乳制品中AFM_(1)的间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)。在最佳实验参数下,AFM_(1)的IC_(50)为0.038 ng/mL,检测限为0.009 ng/mL,较单体Nb-M4的提高了8.63倍和5.56倍。与AFM_(1)类似物和其他常见真菌毒素的交叉反应可忽略不计,且在加标乳样中获得了良好的回收率和可重复性。此外,将所开发的方法应用于实际样品中AFM_(1)的分析,结果与HPLC的结果具有很好的相关性(R^(2)=0.995)。该研究表明,自组装的七聚化纳米抗体是改善亲和力和信号放大的有效策略,今后可用于灵敏、选择性和快速检测食品中的霉菌毒素和其他小分子污染物。

间接竞争酶联免疫吸附法检测保健食品中糖皮质激素类药物

目的建立间接竞争酶联免疫吸附(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法用于保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测。方法将可的松、地塞米松分别与丁二酸酐衍生制备免疫半抗原,倍他米松衍生制备包被半抗原,采用活泼酯法与载体蛋白偶联制备人工抗原,采用紫外(ultraviolet,UV)吸收光谱鉴定及基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption-tandem time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)测定人工抗原的偶联比。通过动物免疫,制备针对糖皮质激素类药物的兔多克隆抗体,建立保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测ic-ELISA法。结果地塞米松丁二酸酐衍生物为免疫半抗原,倍他米松丁二酸酐衍生物为包被半抗原。通过优化实验条件,确定了最佳的包被原质量浓度为1.25μg/m L,以及最佳的抗体稀释倍数为9000倍。在此条件下,本研究建立的ic-ELISA法对11种糖皮质激素类药物的半抑制质量浓度为0.68~40.17 ng/m L,展现了良好的检测灵敏度。使用甲醇超声提取,样品提取液通过标准稀释液稀释500倍消除基质效应,11种目标分析物在4种剂型保健食品中的添加回收率为81.2%~118.7%,变异系数低于14.00%。结论本研究成功制备糖皮质激素类药物的广谱性多克隆抗体,并建立了保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测ic-ELISA法,可用于保健食品中糖皮质激素类药物的快速筛查。

雌二醇间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

建立食品中雌二醇免疫分析方法。将雌二醇进行结构改造合成半抗原并经过核磁氢谱和红外光谱验证,再采用活泼酯法与载体BSA和OVA偶联制备人工抗原,免疫兔子制备多克隆抗体,经过反应条件优化建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法。结果表明:IC50为3.9ng/mL,检测限为0.3ng/mL,交叉反应率均小于1.21%。检测方法具有高灵敏度和特异性,可应用于食品中雌二醇检测试剂盒的研制。

基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理,检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化,初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示:1)在1 mg的磁珠中,沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)单克隆抗体最佳偶联量为15μg,偶联时间60 min,pH为4.4;2)最佳抗原添加量为1 ng·mL^(-1),捕获时间40 min,缓冲液为0.01 mol·L^(-1)PBS,IC50为0.73 ng·mL^(-1),线性范围为1.0~3.2 ng·mL^(-1);3)氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31μg·kg^(-1),回收率为76.83%~98.70%,批内变异系数批间变异系数均不超过15%,经验证,鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法(HPLC)结果一致。结果表明,与传统仪器检测方法相比,该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率,为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphnia magna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8 000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirect and non-competitive enzyme-linked immunosorbentassay)。结果表明:此方法检测灵敏度为24ng.mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg.mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0.25%、<0.25%、2.13%、10.19%、3.88%、3.56%、2.81%、3.93%、5.00%和2.75%,具较高的特异性。说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测。

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

【目的】制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

间接竞争酶联免疫吸附法测定花生中的乙草胺

乙草胺属于酰胺类除草剂，英文名为Acetoclor，化学名为2-乙基-6-甲基-N-（乙氧甲基）-2-氯代乙酰替苯胺，广泛应用于大豆、棉花、花生、玉米等多种作物。乙草胺具有较长的降解周期，对人和动植物有一定的毒害作用，已经被美国环境保护局定为B-2类致癌物，规定其在地下水中的残留量不得超过0．1μg/L。试验应用乙草胺抗体、包被原和过氧化氢酶标记的羊抗兔抗体建立间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）法试剂盒检测花生中的乙草胺残留量，现报道如下。

自制便携式振荡装置/间接竞争酶联免疫吸附法在水库微囊藻毒素-LR快速应急监测中的应用

应用自制便携式振荡装置,运用间接竞争酶联免疫吸附法(icELISA)建立快速测定水中微囊藻毒素(MC)-LR的现场初筛方法。结果表明:(1)自制便携式振荡装置的检测结果与手工振荡不存在差异,可用自制便携式振荡装置替代手工来进行振荡孵育操作。(2)icELISA建立了快速测定MC-LR的现场监测方法,MC-LR的标准曲线线性关系较好(r=-0.997 0),满足定性定量分析的要求,检出限为0.03μg/L,测定下限为0.12μg/L,空白溶液与实际水样加标回收率为96.2%~113.0%,方法精密度、准确度均较好。

间接竞争酶联免疫分析用于薏苡仁中杂色曲霉毒素的快速检测研究

杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin,ST)是一种主要由杂色曲霉和构巢曲霉等真菌产生的次级代谢产物,其结构与黄曲霉毒素相似,具有潜在的致癌性和毒性,严重危害人类生命健康。研究发现部分中药易ST污染,但目前针对中药中ST的快速检测研究相对较少。通过系统优化样品前处理条件及影响检测灵敏度的关键参数,建立了简便的间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA),用于消费量较大的药食同源薏苡仁中ST的快速筛查。所建立ic-ELISA的半数抑制浓度(Half-Maximal Inhibitory Concentration,IC 50)为0.11 ng/mL,线性范围为6.25~100μg/kg,加标回收率在79.27%~99.95%之间,相对标准偏差(RSD)<12%。此外,该方法可抗基质干扰,只需利用溶剂标准曲线即可进行定量。用所建立的ic-ELISA对96批薏苡仁样品进行了检测,并用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对阳性样品进行了确证。该ic-ELISA快速、准确、经济,可作为薏苡仁中ST高通量快筛的技术手段,同时为其他中药中ST的快速检测提供参考。

牛奶中替米考星间接竞争酶联免疫吸附检测法的建立

本研究通过棋盘法优化替米考星抗体、包被原浓度,并考察了最佳包被条件,最佳反应温度、时间和酶标二抗最佳反应时间等,建立了替米考星残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）并应用到牛奶样本的检测。建立的间接竞争ELISA方法半数抑制浓度（IC50）为2.1ng/mL,牛奶中替米考星的最低检测限（LOD）为2μg/L。在5、10和20μg/L添加浓度下,回收率为79.2%-90.1%,变异系数不高于9.0%。与其他常见的大环内酯类药物无交叉反应。本研究建立的替米考星间接竞争ELISA方法灵敏度达到了残留限量标准要求,为开发可用于牛奶中替米考星的快速检测试剂盒奠定基础。

玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

基于伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)单克隆抗体建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA),用于玉米中伏马毒素的初步筛查。该方法优化了抗原包被浓度和单抗体稀释倍数、抗原包被条件、酶标二抗稀释倍数、底物作用时间。结果显示,线性检测范围为1.41~54.2ng/m L,最低检测限为24.5μg/kg,实测玉米样品加标回收率为89.36%~108.54%。交叉反应结果显示,与伏马毒素B2(fumonisin B2,FB2)交叉反应率为129.88%,与其他真菌毒素交叉反应均小于10%,该ic-ELISA方法可对玉米样品中的FB1与FB2总量进行初筛。

间接酶联免疫吸附检测己烯雌酚条件优化

以制备好的抗血清为基础优化间接酶联免疫吸附法的测定条件。采用间接酶联免疫吸附法测定己烯雌酚抗血清效价,用方阵滴定法确定包被浓度和抗血清工作浓度,进而优化稀释缓冲液﹑pH﹑竞争时间等实验条件。选择与DES结构类似的四种药物进行交叉反应,计算交叉反应率。结果表明产生的抗血清的稀释度可以达到1:102400。方阵滴定法确定最佳包被浓度和抗血清工作浓度分别为1:200和1:4000。通过间接ELISA方法建立了标准曲线,抑制曲线表明,兔抗血清中抗体特异性很好,呈现线性关系,其IC50为1.89ng/ml,最低检测限为0.08ng/ml。四种DES结构类似物的交叉反应率除双烯雌酚3.1%外,其余均小于0.1%。从而优化了间接酶联免疫检测条件,建立了己烯雌酚实用的检测方法,为最终组装试剂盒奠定了基础。

间接抑制酶联免疫吸附法测定大豆凝集素方法的建立

本研究用标准抗原、纯化抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ,建立间接抑制酶联免疫吸附法 ,测定了几种不同品种生大豆和豆粕产品的凝集素含量。结果表明 ,间接抑制ELISA检测大豆制品中的凝集素含量变异系数小于 15 % ,样品回收率误差在 15 %以内 ;抑制率在 2 0 %～ 70 %范围内 ,曲线呈现良好的线性关系 ,提取液中的大豆凝集素检测下限为 10mg mL。

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清4型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

应用超声波裂解法制备的血清4型鸭疫里默氏杆菌(RA)裂解物作为抗原包被酶标板,成功建立了4型RA抗体检测的间接ELISA法。

直接竞争酶联免疫吸附-高效液相色谱法测定烯效唑

应用本实验室制备的对烯效唑具特异性亲和力的多克降抗体,采用包被抗体直接竞争模式建立烯效唑的酶联免疫吸附分析法。在优化条件下,对烯效唑标样检测的线性范围为1～10^(-4)mg/L,线性中浓度为1.31μg/L,5次重复测定的相对标准偏差(RSD)为8.4%;检出限为0.022μg/L。在苹果中分别添加烯效唑标样1 0,0.1和0 01 mg/kg;直接竞争E LISA法测定的回收率分别为84.6%～101.0%,99.6%～117 0%和80.8%～92.8%;RSD(n=5)分别为8.6%,6.9%和6.7%。ELISA法对苹果中烯效唑的检出限为0.024μg/kg。在同样前处理条件下,高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UVD)法对苹果中烯效唑的检出限为0.25 mg/kg,苹果中添加1 00 mg/kg烯效唑,HPLC UVD法测定的回收率为92.6%。

检测T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法的研究

目的 本研究在自制T-2毒素酶标半抗原的基础上，结合市售抗T-2毒素单克隆抗体，建立了检测谷物中T-2毒素的直接竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）。方法粮食样品经70％甲醇-水溶液提取，用滤纸过滤并稀释后。再用0．45μm滤器过滤净化，该滤液用于ELISA检测。结果本方法最低检出量为0．125ng／ml，添加70-280ng／g T-2毒素的大米样品和面粉样品的平均回收率分别为85～117．5％和98．1～102．5％。结论结果表明，该方法简化了粮样提取步骤。可用于谷物及加工产品中T-2毒素的检测。

间接酶联免疫吸附技术检测活的非可培养状态的大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌 O157:H7在低温贫营养的条件下可进入活的非可培养状态 (Viable butnonculturable state,VBNC) ,用常规的培养法无法将其检出。作者利用间接酶联免疫吸附技术(Indirect Enzyme- L inked Immunosorbent Assay,EL ISA)检测 VBNC的大肠杆菌 O157:H7,发现此方法可以快速有效地将其检出 ,最小检测浓度为 10 5个 / m L。

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定桃中氰戊菊酯的残留量

采用包被抗体、酶标半抗原直接竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定了氰戊菊酯在桃中的残留量。结果表明：在氰戊菊酯多克隆抗体包被浓度为4．0mg／L、辣根过氧化物酶（HRP）标记氰戊菊酯半抗原稀释1．0×10^5倍条件下，ELISA法检测氰戊菊酯的线性浓度范围为0．01-10mg／L，氰戊菊酯对抗体．酶标半抗原反应的抑制中浓度（IC50）为193μg／L，相对标准偏差（RSD，n=5）为4．5％，IC20为13．5μg／L。在2、0．2和0．05mg／kg添加水平下，ELISA法测定桃中氰戊菊酯的回收率分别为81％-89％、85％～98％和85％-106％，RSD（n=5）分别为5．1％、5．6％和7．7％。ELISA法对桃中氰戊菊酯的最低检出浓度为0．014mg／kg。