食品中黄曲霉毒素M_(1)的间接竞争酶联免疫法的建立

该文建立一种间接竞争酶联免疫法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)快速测定食品中黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))的分析方法。AFM_(1)标准品用甲醇稀释,AFM_(1)标准品与AFM_(1)全抗原竞争结合AFM_(1)单克隆抗体,利用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)单组分显色液显色后,酶标仪测定吸光度。在优化好的条件下,浓度范围为9.743~2.605×10^(3)pg/mL时具有良好的线性关系,相关系数(determination coefficient,R^(2))为0.9927,检出限IC_(10)为3.84 pg/mL,加标回收率为88.43%~105.75%。该方法适用性好、操作简单、灵敏度高,满足食品中AFM_(1)分析检测的需求。

基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理,检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化,初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示:1)在1 mg的磁珠中,沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)单克隆抗体最佳偶联量为15μg,偶联时间60 min,pH为4.4;2)最佳抗原添加量为1 ng·mL^(-1),捕获时间40 min,缓冲液为0.01 mol·L^(-1)PBS,IC50为0.73 ng·mL^(-1),线性范围为1.0~3.2 ng·mL^(-1);3)氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31μg·kg^(-1),回收率为76.83%~98.70%,批内变异系数批间变异系数均不超过15%,经验证,鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法(HPLC)结果一致。结果表明,与传统仪器检测方法相比,该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率,为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

【目的】制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphnia magna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8 000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirect and non-competitive enzyme-linked immunosorbentassay)。结果表明:此方法检测灵敏度为24ng.mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg.mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0.25%、<0.25%、2.13%、10.19%、3.88%、3.56%、2.81%、3.93%、5.00%和2.75%,具较高的特异性。说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测。

自制便携式振荡装置/间接竞争酶联免疫吸附法在水库微囊藻毒素-LR快速应急监测中的应用

应用自制便携式振荡装置,运用间接竞争酶联免疫吸附法(icELISA)建立快速测定水中微囊藻毒素(MC)-LR的现场初筛方法。结果表明:(1)自制便携式振荡装置的检测结果与手工振荡不存在差异,可用自制便携式振荡装置替代手工来进行振荡孵育操作。(2)icELISA建立了快速测定MC-LR的现场监测方法,MC-LR的标准曲线线性关系较好(r=-0.997 0),满足定性定量分析的要求,检出限为0.03μg/L,测定下限为0.12μg/L,空白溶液与实际水样加标回收率为96.2%~113.0%,方法精密度、准确度均较好。

玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

基于伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)单克隆抗体建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA),用于玉米中伏马毒素的初步筛查。该方法优化了抗原包被浓度和单抗体稀释倍数、抗原包被条件、酶标二抗稀释倍数、底物作用时间。结果显示,线性检测范围为1.41~54.2ng/m L,最低检测限为24.5μg/kg,实测玉米样品加标回收率为89.36%~108.54%。交叉反应结果显示,与伏马毒素B2(fumonisin B2,FB2)交叉反应率为129.88%,与其他真菌毒素交叉反应均小于10%,该ic-ELISA方法可对玉米样品中的FB1与FB2总量进行初筛。

间接抑制酶联免疫吸附法测定大豆凝集素方法的建立

本研究用标准抗原、纯化抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ,建立间接抑制酶联免疫吸附法 ,测定了几种不同品种生大豆和豆粕产品的凝集素含量。结果表明 ,间接抑制ELISA检测大豆制品中的凝集素含量变异系数小于 15 % ,样品回收率误差在 15 %以内 ;抑制率在 2 0 %～ 70 %范围内 ,曲线呈现良好的线性关系 ,提取液中的大豆凝集素检测下限为 10mg mL。

间接免疫荧光法与酶联免疫吸附试验检测抗核抗体对比分析

目的:应用间接免疫荧光法(indirect immunofluoreseent assay,IF)与酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)检测临床疑似自身免疫疾病患者血清抗核抗体并进行相关性及对比分析。方法:IF法按说明书操作,在荧光显微镜下观察到特异的荧光核型为阳性;ELISA法按说明书操作,浓度≥18U/mL为阳性,12～18U/mL为可疑,≤12U/mL为阴性。结果:检测临床疑似自身免疫患者血清138份,IF法阳性50份,阴性88份,阳性率36.23%,ELISA法阳性78份,阴性60份,阳性率56.52%。经卡方检验P<0.01。其中IF法样本血清稀释倍数与ELISA法检测浓度的Spearman相关系数为0.499。结论:两种方法检测抗核抗体差异有显著性,ELISA法敏感度明显高于IF法。同时,IF法样本血清抗核抗体血清稀释倍数与ELISA法的浓度呈一定相关性。

比较酶联免疫吸附法与间接免疫荧光法检测抗核抗体的价值

目的比较ELISA法和间接免疫荧光(IIF)法诊断自身免疫疾病的价值。方法系统性红斑狼疮(SLE)组33例,非SLE自身免疫疾病组59例,非自身免疫疾病组43例,同期该院体检中心健康体检者20例纳入健康对照组。采用2种方法检测4组研究对象的抗核抗体(ANA),并进行分析。结果 ELISA法检测SLE组、非SLE自身免疫疾病组中高效价的ANA分别为(2.621±1.700)、(2.248±1.781),IIF法分别为(2.715±0.730)、(2.544±0.59),但前者测出非自身免疫疾病中的ANA(1.034±1.050)低于后者ANA的效价(2.253±0.691)。结论 ELISA检测可提高ANA的检测效果。

酶联免疫吸附法和间接免疫荧光法检测抗dsDNA抗体方法的比较

目的比较酶联免疫吸附法（ELISA）和间接免疫荧光法（IIF）检测抗dsDNA抗体的检出情况及符合率。方法用酶联免疫吸附法和间接免疫荧光法同时检测286份临床疑为系统性红斑狼疮（SLE）的病人血清。结果286份样本中ELISA法捡出31例抗dsDNA抗体阳性，255例抗dsDNA抗体阴性，而在ELISA法检出31例抗dsDNA抗体阳性中IIF法检测仅有13例阳性，阳性符合率仅为41．94％。ELISA法检出的255例抗dsDNA抗体阴性标本中IIF法检测有255例阴性，职性符合率100％。ELISA法和IIF法检测抗dsDNA抗体的阳性检出率有显著性差异。结论ELISA法和IIF法检测抗dsDNA抗体的阳性检出率差异有统计学显著性意义（P〈0．05），ELISA法检测抗dsDNA抗体简便、快速、设备要求不高，可以用于大批量的抗dsDNA筛壹，但因为特异性不高，假阳性较多，因此有条件的实验室最好采用IIF法对阳性结果进行复检确认。

生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤

目的将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-c ELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测,建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法将NH2活性生物素与MTX单抗Ig G化学连接,采用亲和素-HRP酶标记系统,建立放大竞争酶联免疫吸附法,连续制备5批试剂盒,对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证,检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度,并对其检测结果进行判定。结果建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性,检测MTX的灵敏度达到0.087 ng/m L,检测下限为0.137 ng/m L,检测线性范围为0.1~10 ng/m L;批内RSD为3.3%~8.7%,平均批内差异为6.5%,批间RSD为7.6%~9.9%,重复性教好,检测回收率为94.2%~112.8%。结论生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX,操作简单,具有较好的灵敏度和特异性。

牛奶中替米考星间接竞争酶联免疫吸附检测法的建立

本研究通过棋盘法优化替米考星抗体、包被原浓度,并考察了最佳包被条件,最佳反应温度、时间和酶标二抗最佳反应时间等,建立了替米考星残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）并应用到牛奶样本的检测。建立的间接竞争ELISA方法半数抑制浓度（IC50）为2.1ng/mL,牛奶中替米考星的最低检测限（LOD）为2μg/L。在5、10和20μg/L添加浓度下,回收率为79.2%-90.1%,变异系数不高于9.0%。与其他常见的大环内酯类药物无交叉反应。本研究建立的替米考星间接竞争ELISA方法灵敏度达到了残留限量标准要求,为开发可用于牛奶中替米考星的快速检测试剂盒奠定基础。

GA_4间接酶联免疫吸附测定方法的建立

利用 GA_4-17-BSA 作为免疫抗原,GA_4-16-OA 作为包被抗原,建立了检测自由态 GA_4的间接ELISA。检测极限为4.1ng/mL,抗血清与 GA_7,GA_3,GA_4-ME 的交叉反应率分别为68.51%,9.10%。1.90%,与 IAA,ABA,ZR 交叉反应率极小。

间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法检测血清中抗双链DNA抗体在系统性红斑狼疮中的诊断价值

抗双链DNA（double-stranded DNA,dsDNA）抗体主要见于系统性红斑狼疮（systemic lupuserythematosus,SLE）,对诊断SLE有较高的特异性,被称为SLE的＂标记性抗体＂,其对SLE的高度特异性而被列为SLE诊断标准之一。

操作时差对竞争酶联免疫吸附试验法检测抗-HBc结果的影响

本研究采用操作时差对竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测抗-HBc结果影响的探讨,现将结果报告如下。 1材料与方法 1.1材料来源：66份血清标本随机采自2006年12月我院住院、门诊患者和健康体检者,干管抽静脉血3～5mL,37℃水浴箱放置15min后3000r／min离心15min，充分分离血清，-80℃低温冰箱冻存备检。

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

目的采用酶标抗原建立高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争酶联免疫吸附法(direct competitive enzyme linked immunosorbent assay,dc-ELISA)检测食品中三聚氰胺(melamine,MEL)残留。方法以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗原与标准品(或样品)中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系,以三聚氰胺标准品建立标准曲线进行定量。结果方法的IC_(50)为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9~35μg/L;检测样品的回收率在70%~120%之间,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论本方法灵敏度高、特异性强,可以满足实际样品的快速检测需求。

间接竞争酶联免疫分析法快速检测决明子中黄曲霉毒素B_(1)的研究

目的:建立适用于中药决明子中黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))快速检测的间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。方法:首先采用棋盘滴定法优化抗原抗体最佳浓度,建立抑制曲线,然后以显色值和灵敏度为评价指标筛选样品的提取和稀释方法。对所建立的方法进行方法学考察,最后用于实际样品检测。结果:经过优化,确定样品的最佳提取溶剂为乙腈-甲醇溶液(90∶10,v/v),稀释溶液为甲醇-PBS溶液(10∶90,v/v),稀释倍数为20倍。方法的半数抑制浓度为0.078 ng/mL,线性范围为0.016~0.25 ng/mL,回收率为85.00%~109.2%,RSD为0.45%~9.08%。采用所建立的方法对25批决明子进行了检测,经液相色谱-串联质谱法确证,超过限量标准的样品的假阳性率小于5%。结论:本文所建立的ic-ELISA灵敏、简便,适用于决明子中AFB_(1)的快速筛查,但仍存在一定的假阳性率,后续还需要对产生干扰的基质因素进行研究并消除,进一步提高检测的准确度。

酶联免疫吸附试验和间接荧光免疫法检测抗双链DNA抗体的评价

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）属于全身性自身免疫病，病变一般累及身体的系统器官、关节以及脏器，并且各种自身抗体出现于血清内，在表现形式上，临床上具有多样性，并且非活动期与活动期相互交替出现是该疾病的典型特点[1]。SLE这一类疾病好发于女性[2]，然而迄今为止对其发病机制尚不清楚，本研究应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法及间接荧光免疫法（IIF）检测SLE患者和对照组血清的抗双链DNA（dsDNA）抗体，以评价2种检测方法在SLE诊断中的临床价值。

直接竞争酶联免疫吸附法检测虾过敏蛋白

目的:建立酶标抗原的直接竞争酶联免疫吸附法(dcELISA)检测食品中虾过敏蛋白,为食品过敏诊断试剂的开发和应用提供理论基础。方法:提取虾主要过敏蛋白,免疫小鼠制备抗虾过敏蛋白多克隆抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原,建立酶标抗原的dcELISA检测虾过敏蛋白。结果:所建立的dcELISA法最低检测限为3.94ng/mL,标准曲线在0.12～128.86ng/mL范围内线性良好,批内和批间变异系数分别为6.16%和2.73%,回收率为82%～98%。结论:该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为进一步研制检测虾过敏蛋白的ELISA试剂盒提供有效的方法。