间接竞争酶联免疫吸附法检测保健食品中糖皮质激素类药物

目的建立间接竞争酶联免疫吸附(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法用于保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测。方法将可的松、地塞米松分别与丁二酸酐衍生制备免疫半抗原,倍他米松衍生制备包被半抗原,采用活泼酯法与载体蛋白偶联制备人工抗原,采用紫外(ultraviolet,UV)吸收光谱鉴定及基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption-tandem time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)测定人工抗原的偶联比。通过动物免疫,制备针对糖皮质激素类药物的兔多克隆抗体,建立保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测ic-ELISA法。结果地塞米松丁二酸酐衍生物为免疫半抗原,倍他米松丁二酸酐衍生物为包被半抗原。通过优化实验条件,确定了最佳的包被原质量浓度为1.25μg/m L,以及最佳的抗体稀释倍数为9000倍。在此条件下,本研究建立的ic-ELISA法对11种糖皮质激素类药物的半抑制质量浓度为0.68~40.17 ng/m L,展现了良好的检测灵敏度。使用甲醇超声提取,样品提取液通过标准稀释液稀释500倍消除基质效应,11种目标分析物在4种剂型保健食品中的添加回收率为81.2%~118.7%,变异系数低于14.00%。结论本研究成功制备糖皮质激素类药物的广谱性多克隆抗体,并建立了保健食品中糖皮质激素类药物多残留检测ic-ELISA法,可用于保健食品中糖皮质激素类药物的快速筛查。

食品中黄曲霉毒素M_(1)的间接竞争酶联免疫法的建立

该文建立一种间接竞争酶联免疫法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)快速测定食品中黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))的分析方法。AFM_(1)标准品用甲醇稀释,AFM_(1)标准品与AFM_(1)全抗原竞争结合AFM_(1)单克隆抗体,利用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)单组分显色液显色后,酶标仪测定吸光度。在优化好的条件下,浓度范围为9.743~2.605×10^(3)pg/mL时具有良好的线性关系,相关系数(determination coefficient,R^(2))为0.9927,检出限IC_(10)为3.84 pg/mL,加标回收率为88.43%~105.75%。该方法适用性好、操作简单、灵敏度高,满足食品中AFM_(1)分析检测的需求。

基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理,检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化,初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示:1)在1 mg的磁珠中,沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)单克隆抗体最佳偶联量为15μg,偶联时间60 min,pH为4.4;2)最佳抗原添加量为1 ng·mL^(-1),捕获时间40 min,缓冲液为0.01 mol·L^(-1)PBS,IC50为0.73 ng·mL^(-1),线性范围为1.0~3.2 ng·mL^(-1);3)氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31μg·kg^(-1),回收率为76.83%~98.70%,批内变异系数批间变异系数均不超过15%,经验证,鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法(HPLC)结果一致。结果表明,与传统仪器检测方法相比,该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率,为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。

化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附试验检测外周血γ-干扰素诊断结核分枝杆菌感染的结果分析

目的对化学发光免疫分析法(CLIA)检测外周血γ-干扰素(IFN-γ)结果为阴性、灰区、弱阳性、不确定和阳性标本进行分析,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行复测,同时对γ-干扰素释放试验(IGRA)辅助诊断结核分枝杆菌(MTB)感染的临界值设定及应用价值进行探讨。方法将行CLIA-IGRA检查的患者标本共299例纳入研究,根据检测结果分为3组,A组(T-N<14 pg/mL)118例,B组(T-N:14~50 pg/mL)138例,C组(T-N>50 pg/mL)43例,T为测试培养管,N为本底对照培养管。利用ELISA进行复测,比较两种检测方法的结果一致性。计算不同临界值下的灵敏度和特异度,Kappa检验评价两种检测方法的一致性、灵敏度、特异度;ROC曲线分析两种检测方法的诊断性能。结果两种检测方法对于A组和C组样本的检测结果一致性较高,符合率分别为96.61%和93.02%,与B组样本检测得到的IGRA阳性率比较,差异有统计学意义(χ2=142.04,P<0.001)。CLIA和ELISA检测确诊结核患者、潜伏性MTB感染患者、非结核患者的阳性率分别为68.97%、72.60%、49.23%和44.83%、32.88%、14.21%,两者对潜伏性MTB感染和非结核患者检测的阳性率比较差异具有统计学意义(P<0.05)。当以40 pg/mL为临界值时,两种检测方法的特异度均较高,分别为88.80%和91.37%,一致性较好(总符合率94.60%,Kappa=0.779)。结论两种检测方法在检测MTB感染的样本具有较好的一致性,但对于易与结核混淆的非MTB感染者标本需要提高临界值来判定IFN-γ的结果,CLIA检测具有检测时间短、自动化优势,在MTB感染筛查方面具有较高的临床应用价值。

自制便携式振荡装置/间接竞争酶联免疫吸附法在水库微囊藻毒素-LR快速应急监测中的应用

应用自制便携式振荡装置,运用间接竞争酶联免疫吸附法(icELISA)建立快速测定水中微囊藻毒素(MC)-LR的现场初筛方法。结果表明:(1)自制便携式振荡装置的检测结果与手工振荡不存在差异,可用自制便携式振荡装置替代手工来进行振荡孵育操作。(2)icELISA建立了快速测定MC-LR的现场监测方法,MC-LR的标准曲线线性关系较好(r=-0.997 0),满足定性定量分析的要求,检出限为0.03μg/L,测定下限为0.12μg/L,空白溶液与实际水样加标回收率为96.2%~113.0%,方法精密度、准确度均较好。

生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤

目的将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-c ELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测,建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法将NH2活性生物素与MTX单抗Ig G化学连接,采用亲和素-HRP酶标记系统,建立放大竞争酶联免疫吸附法,连续制备5批试剂盒,对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证,检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度,并对其检测结果进行判定。结果建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性,检测MTX的灵敏度达到0.087 ng/m L,检测下限为0.137 ng/m L,检测线性范围为0.1~10 ng/m L;批内RSD为3.3%~8.7%,平均批内差异为6.5%,批间RSD为7.6%~9.9%,重复性教好,检测回收率为94.2%~112.8%。结论生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX,操作简单,具有较好的灵敏度和特异性。

操作时差对竞争酶联免疫吸附试验法检测抗-HBc结果的影响

本研究采用操作时差对竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测抗-HBc结果影响的探讨,现将结果报告如下。 1材料与方法 1.1材料来源：66份血清标本随机采自2006年12月我院住院、门诊患者和健康体检者,干管抽静脉血3～5mL,37℃水浴箱放置15min后3000r／min离心15min，充分分离血清，-80℃低温冰箱冻存备检。

莫米松糠酸酯高特异性抗体制备及酶联免疫分析方法

莫米松糠酸酯(mometasone furoate,MF)是一种常见的糖皮质激素。为快速、便捷地监控MF的滥用情况,制备了MF单克隆抗体并建立了其竞争酶联免疫检测方法。将氨氧乙酸分别连接至MF和莫米松二糠酸酯(mometasone difuroate,MDF),合成了免疫半抗原和包被半抗原。免疫半抗原以活泼脂法连接钥孔血蓝蛋白获得全抗原,通过免疫小鼠、细胞融合及筛选获得能够稳定分泌抗MF单克隆抗体的细胞株,制备并纯化了抗体。该抗体的主要识别区域为MF的五元环区域,因此不和常见的64种糖皮质激素发生交叉反应。建立了基于异源包被的MF间接竞争酶联免疫检测法,其半抑制浓度(IC_(50))为1.2 ng/mL,对肌肉和肝脏的最低检出限分别为0.52μg/kg和0.59μg/kg。灵敏度相比于同源包被提升了20倍。使用60%甲醇水溶液提取动物组织的添加回收率为70%~82%。该方法能有效应用于动物组织中MF的快速筛查。

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphnia magna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8 000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirect and non-competitive enzyme-linked immunosorbentassay)。结果表明:此方法检测灵敏度为24ng.mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg.mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0.25%、<0.25%、2.13%、10.19%、3.88%、3.56%、2.81%、3.93%、5.00%和2.75%,具较高的特异性。说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测。

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

【目的】制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

快速定量分析牛乳中α-乳白蛋白的竞争酶联免疫吸附法

建立一种灵敏度高和特异性好的直接竞争ELISA法来定性和定量检测牛乳中α-乳白蛋白（α-LA）.通过使用牛乳α-LA多次免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并采用过碘酸钠氧化法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的α-LA,建立检测α-LA的直接竞争ELISA法.所制备的多克隆抗体特异性较高,无明显交叉反应,效价为1∶80 920.酶标抗原的标记率达66.67%.直接竞争ELISA法标准曲线相关系数为0.998 57,回收率在86.00%-117.50%之间,重复性高,变异系数〈5%.与国标电泳方法进行样品检测比较,结果显示该方法可有效地用于食品中α-LA的快速定性和定量检测.

间接酶联免疫吸附分析法对环境水样中左旋18-甲基炔诺酮含量的测定

本文报道测定环境水样中的左旋18-甲基炔诺酮(NG)的间接酶联免疫吸附分析法(ELISA)。通过对左旋18-甲基炔诺酮的化学修饰,将左旋18-甲基炔诺酮与蛋白质载体结合,制成完全免疫抗原,经过多次动物免疫得到了兔抗左旋18-甲基炔诺酮抗体,在优化实验条件的基础上,建立了灵敏度高、特异性强、简便、稳定的测定水样中左旋18-甲基炔诺酮的酶联免疫吸附分析方法。IC50值(标准曲线中吸光度抑制至最大吸光度值的50%时所对应的待测物浓度)在1μg/L^5μg/L,最低检出限为0.05μg/L^0.1μg/L。水样的加标回收率在88%~140%之间。真实环境水样中,均发现含有左旋18-甲基炔诺酮,浓度在0.3μg/L-0.6μg/L之间。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8 mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍.在优化条件下,方法的线性范围0.2～1000 μg/L;最低检出限0.05 μg/L.所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意.

间接抑制酶联免疫吸附法测定大豆凝集素方法的建立

本研究用标准抗原、纯化抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ,建立间接抑制酶联免疫吸附法 ,测定了几种不同品种生大豆和豆粕产品的凝集素含量。结果表明 ,间接抑制ELISA检测大豆制品中的凝集素含量变异系数小于 15 % ,样品回收率误差在 15 %以内 ;抑制率在 2 0 %～ 70 %范围内 ,曲线呈现良好的线性关系 ,提取液中的大豆凝集素检测下限为 10mg mL。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定二乙基磷酸酯类有机磷农药

基于生物素和亲和素之间发生特异性反应,形成多酶系统,建立了二乙基磷酸酯类有机磷农药的竞争酶联免疫分析技术和生物素-亲和素放大酶联免疫分析技术。在优化条件下,二乙基磷酸酯类有机磷农药浓度在1×10-1～1×104mg/L范围内与抑制率线性关系良好,其线性回归方程为y=0.1168x+0.6259(r=0.9889),半抑制浓度和检出限分别为34 mg/L和0.0248 mg/L,与间接竞争酶联免疫分析方法相比,在交叉反应率基本不变的情况下,检测灵敏度和检测范围都得到显著提高,实际样品的加标回收率为70.1%～117.8%,基本满足痕量物质分析的要求。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定呋喃西林代谢物

目的建立竞争生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(biotin-avidin enzyme linked immumosobent assay,BA-ELISA)检测呋喃西林代谢物。方法采用棋盘法确定单克隆抗体和包被原的最佳稀释倍数,通过单因素试验优化辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)稀释倍数、封闭液浓度、竞争反应时间、生物素标记羊抗鼠二抗(biotinylated goat anti-mouse Immunoglobulin G,Biotin-IgG)孵育时间、SA-HRP孵育时间和显色时间,建立标准曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果最佳实验条件为:包被原稀释倍数为1:800,单克隆抗体稀释倍数为1:12800,SA-HRP稀释倍数为1:8000,封闭液为1%的脱脂乳,竞争反应时间为30 min,Biotin-IgG孵育时间为30 min,SA-HRP孵育时间为60 min,显色时间为15 min;在优化条件下,线性方程为Y=-0.3299X+0.4272(r^2=0.990),IC_(50)为0.601ng/m L,线性范围为0.074~4.883 ng/m L;加标回收率为88.8%~98.5%,批内变异系数(coefficient of variation,CV)和批间CV分别为1.2%~3.6%和2.5%~5.1%,建立的方法与其他结构类似物及衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。BA-ELISA与高效液相色谱-串联质谱法的回收率均在85%~115%范围内。结论 BA-ELISA法灵敏度高、特异性好、重现性好,可适用于动物组织中呋喃西林代谢物的快速筛查。

间接免疫荧光法与酶联免疫吸附试验检测抗核抗体对比分析

目的:应用间接免疫荧光法(indirect immunofluoreseent assay,IF)与酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)检测临床疑似自身免疫疾病患者血清抗核抗体并进行相关性及对比分析。方法:IF法按说明书操作,在荧光显微镜下观察到特异的荧光核型为阳性;ELISA法按说明书操作,浓度≥18U/mL为阳性,12～18U/mL为可疑,≤12U/mL为阴性。结果:检测临床疑似自身免疫患者血清138份,IF法阳性50份,阴性88份,阳性率36.23%,ELISA法阳性78份,阴性60份,阳性率56.52%。经卡方检验P<0.01。其中IF法样本血清稀释倍数与ELISA法检测浓度的Spearman相关系数为0.499。结论:两种方法检测抗核抗体差异有显著性,ELISA法敏感度明显高于IF法。同时,IF法样本血清抗核抗体血清稀释倍数与ELISA法的浓度呈一定相关性。

比较酶联免疫吸附法与间接免疫荧光法检测抗核抗体的价值

目的比较ELISA法和间接免疫荧光(IIF)法诊断自身免疫疾病的价值。方法系统性红斑狼疮(SLE)组33例,非SLE自身免疫疾病组59例,非自身免疫疾病组43例,同期该院体检中心健康体检者20例纳入健康对照组。采用2种方法检测4组研究对象的抗核抗体(ANA),并进行分析。结果 ELISA法检测SLE组、非SLE自身免疫疾病组中高效价的ANA分别为(2.621±1.700)、(2.248±1.781),IIF法分别为(2.715±0.730)、(2.544±0.59),但前者测出非自身免疫疾病中的ANA(1.034±1.050)低于后者ANA的效价(2.253±0.691)。结论 ELISA检测可提高ANA的检测效果。

质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法检测沙眼衣原体

目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病原菌行Gap-LCR-ELISA。结果:质粒Gap-LCR-ELISA可检测出6型CT,并与其他病原体无交叉反应,其最低检测限为2.5个原体(elementarybodiesEB)比PCR敏感10倍。结论:质粒Gap-LCR-ELISA对检测CT感染具有极高的灵敏度和特异度,适宜于我国进行大规模CT流行病学调查。

酶联免疫吸附法和间接免疫荧光法检测抗dsDNA抗体方法的比较

目的比较酶联免疫吸附法（ELISA）和间接免疫荧光法（IIF）检测抗dsDNA抗体的检出情况及符合率。方法用酶联免疫吸附法和间接免疫荧光法同时检测286份临床疑为系统性红斑狼疮（SLE）的病人血清。结果286份样本中ELISA法捡出31例抗dsDNA抗体阳性，255例抗dsDNA抗体阴性，而在ELISA法检出31例抗dsDNA抗体阳性中IIF法检测仅有13例阳性，阳性符合率仅为41．94％。ELISA法检出的255例抗dsDNA抗体阴性标本中IIF法检测有255例阴性，职性符合率100％。ELISA法和IIF法检测抗dsDNA抗体的阳性检出率有显著性差异。结论ELISA法和IIF法检测抗dsDNA抗体的阳性检出率差异有统计学显著性意义（P〈0．05），ELISA法检测抗dsDNA抗体简便、快速、设备要求不高，可以用于大批量的抗dsDNA筛壹，但因为特异性不高，假阳性较多，因此有条件的实验室最好采用IIF法对阳性结果进行复检确认。