间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。

间接竞争ELISA法测定稻田土壤中除草剂毒莠定的残留量

通过对反应体系中酶标二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG）和抗体的最佳稀释浓度等条件的筛选和确定,最终建立了一种快速灵敏地测定污染稻田土壤中毒莠定残留量的方法--间接竞争ELISA分析方法.结果表明,酶标二抗和抗体的最佳稀释度均为1：500（体积比）,毒莠定的检出下限达到5 ng·mL^-1,在0.07～0.7μg·mL^-1浓度范围内有良好的线性;土壤浸出液加样的平均回收率为104.11%,变异系数在3.13%～11.13%之间,符合农药残留分析的要求;样品基质对检测结果没有干扰.

检测牛乳κ-酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较

试验旨在建立一种快速简单检测牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)含量的酶联免疫吸附(ELISA)方法,为解决牛乳蛋白掺假问题提供一定的技术支持。以牛乳κ-CN为包被抗原,以酶标抗体(HRP-IgG)为检测抗体分别建立间接竞争ELISA法和间接ELISA法,并对两种检测方法进行分析比较。结果表明:对于间接竞争ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为2.5μg/mL,线性范围为62.5~1 000.0ng/mL,变异系数<2%,回收率在98.46%~101.68%;对于间接ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为1.56μg/mL,线性范围为0.098~3.125μg/mL,变异系数<1%,回收率在99.10%~101.06%。比较两种检测方法,间接竞争ELISA法检测耗时较短,抗体应用量较少,而间接法不需要包被成本较高的目标标准蛋白,相关系数也较高,但其检测体系组成成分较多,且需包被待测样品,较难组成ELISA试剂盒体系,不宜用于现场检测。因此,大规模制备ELISA试剂盒体系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争法,不仅抗体应用量少、节约成本且快速、简单,可更好地用于科研实践。

间接竞争ELISA法检测饲料中盐酸克伦特罗的探讨

建立检测饲料中盐酸克伦特罗含量的间接酶联免疫吸附法(ELISA),并分析该方法的特异性和敏感性。用抗原包被酶标板,兔抗羊盐酸克伦特罗(CLB)抗体为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为二抗,建立CLB定量检测的间接ELISA法。结果显示,所建立的用于饲料中CLB含量检测的间接ELISA方法特异性好,灵敏度高。试验结果表明,间接ELISA法可以用于测定饲料中盐酸克伦特罗含量,具有良好的灵敏度和稳定性。

间接竞争ELISA法检测黄连解毒汤中黄芩苷在大鼠脑脊液中的分布

目的检测黄连解毒汤灌胃给药后黄芩苷在大鼠脑脊液中的分布。方法通过考察线性关系、精密度、回收率等方法学考察指标,建立基于黄芩苷单克隆抗体的间接竞争ELISA(icELISA)法;通过建立的icELISA法,检测大鼠灌胃给药后1小时、2小时、3小时和4小时脑脊液中黄芩苷的含量。结果在大鼠脑脊液中建立的黄芩苷标准曲线为y=0.1069ln(x)+1.0144(R 2=0.9885),浓度范围为3.2~2000 ng/mL,在400、80、3.2 ng/mL三个浓度的精密度分别为13.14%、6.65%和6.04%(RSD≤15%),回收率分别为91.35%、87.04%和117.67%(SD≤15%)。给药后1小时、2小时、3小时和4小时脑脊液中黄芩苷的平均含量分别为(60.53±18.05)、(223.32±29.72)、(121.35±31.93)、(4.46±2.54)ng/mL。结论在脑脊液中建立的黄芩苷icELISA检测法灵敏度高、精密度和回收率能够满足生物样品的检测要求,可以作为黄芩苷的检测方法。在脑脊液中可以检出黄芩苷,给药后2小时黄芩苷在脑脊液中的浓度最高,然后随时间逐渐降低,说明黄芩苷可以透过血脑屏障从而分布到脑脊液中,为黄芩苷治疗脑部疾病提供了直接的实验依据。

食品中黄曲霉毒素M_(1)的间接竞争酶联免疫法的建立

该文建立一种间接竞争酶联免疫法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)快速测定食品中黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))的分析方法。AFM_(1)标准品用甲醇稀释,AFM_(1)标准品与AFM_(1)全抗原竞争结合AFM_(1)单克隆抗体,利用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)单组分显色液显色后,酶标仪测定吸光度。在优化好的条件下,浓度范围为9.743~2.605×10^(3)pg/mL时具有良好的线性关系,相关系数(determination coefficient,R^(2))为0.9927,检出限IC_(10)为3.84 pg/mL,加标回收率为88.43%~105.75%。该方法适用性好、操作简单、灵敏度高,满足食品中AFM_(1)分析检测的需求。

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒g G蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV g G蛋白,并采用切胶纯化该重组g G蛋白(rg G)后经western blot检测纯化的rg G (P-rg G)与本研究室制备的g G蛋白单克隆抗体(MAb) 3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示,P-rg G与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200。以P-rg G作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV g G蛋白间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示,P-rg G包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)≥31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID_(50)),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rg G分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1∶320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID_(50)/0.1 m L;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR (q PCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60)。q PCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV g G蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。

牛乳过敏原β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立

检测牛乳中的主要过敏原β-乳球蛋白,利用β-乳球蛋白纯品免疫新西兰白兔,制得兔抗牛β-乳球蛋白的多克隆抗体,以β-乳球蛋白包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗、四甲基联苯胺（TMB）为底物,建立了牛乳中β-乳球蛋白的间接竞争酶联免疫检测法（ELISA）。确定了包被抗原质量浓度为0.5μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶6 400,酶标二抗稀释度为1∶10 000。结果达到批内误差3.87%,批间误差6.51%;检测的线性范围为0.05～1.00μg/mL,标准曲线回归方程y=-1.930 2x-0.124 1,相关系数为0.994 5,说明所建立的方法灵敏度高,具有良好的准确性和重复性。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素间接竞争ELISA检测方法的建立

以金黄色葡萄球菌B型肠毒素免疫Balb/c小鼠,待血清效价达到要求后,腹腔注射骨髓瘤细胞,制备抗金黄色葡萄球菌B型肠毒素抗体,并建立快速检测金黄色葡萄球菌B型肠毒素的间接竞争ELISA(ciELISA)方法。经方阵滴定确定B型肠毒素的最佳包被浓度为0.31μg/ml,抗B型肠毒素抗体的稀释度为1:1.2×104,羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1:103。本实验建立的B型肠毒素的间接竞争ELISA检测方法的最低检测量为1ng/ml,线性检测范围为1～103ng/ml,相关系数R2=0.9951,人工污染样品的平均回收率为94.5%。

拉沙里菌素单克隆抗体的研制及间接竞争ELISA检测方法的建立

为制备拉沙里菌素(LAS)单克隆抗体,建立针对LAS的间接竞争ELISA(Ci-ELISA)方法,试验采用了活性酯法将LAS分别与BSA和OVA偶联成LAS-BSA和LAS-OVA作为免疫原和检测原,6次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,最终筛选出一株能稳定分泌抗LAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株C11。经鉴定,C11的抗体类型为Ig G1,轻链为κ链;所制腹水效价为1∶16 000,与莫能菌素钠、盐霉素钠、马杜霉素胺、头孢噻吩钠和硫酸链霉素均无交叉反应。用此单克隆抗体建立LAS Ci-ELISA检测方法显示,Ci-ELISA标准工作曲线为y=0.376x-0.2374(R2=0.9914),LAS在5~1 000 ng/m L时,线性关系良好,IC50为90.22 ng/m L,加标回收率为81.76%~102.41%,表明方法精确度好、灵敏度高。LAS单克隆抗体的制备和Ci-ELISA方法的建立为下一步试剂盒的研发奠定了基础。

氟喹诺酮类药物多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立同时检测多种氟喹诺酮药物的免疫学分析方法,本研究以碳二亚胺(EDC)二步法合成环丙沙星人工抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立氟喹诺酮类药物多残留检测方法。标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.2 ng/mL～376 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为8 ng/mL,检测限(LOD)为0.1 ng/mL;抗体对恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星均能特异性识别,IC50值分别为7.3 ng/mL、10.6 ng/mL、和13.2 ng/mL;标准品稀释液中NaOH和甲醇的最高容忍度分别为10%和30%;牛奶基质中添加5 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL的标准品,环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星的回收率分别为93%～108%、96%～110%、92.5%～104%和93%～102%。

伏马毒素B_1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立

采用戊二醛法将半抗原伏马毒素B1分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和蛋白卵清白蛋白（OVA）偶联成为完全抗原KLH-FB1和OVA-FB1。OVA-FB1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-FB1作为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体。经三次亚克隆后,筛选出两株（6H3,6H11）能特异、稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,经检测表明单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ型。采用间接ELISA测得腹水纯化后效价达l∶16 000,抗体对伏马毒素的半数阻断浓度（IC50）为8.26 ng/mL,对玉米赤霉烯酮、黄曲霉素B1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其他结构的氯丙嗪、链霉素等无交叉反应。利用获得的抗FB1单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA检测方法,检测灵敏度为0.44 ng/mL,检测线性范围为0.93~73.06 ng/mL,加标回收率在线性范围内达到回收率可达78.4%~102%。

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。

孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法的建立

采用无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿(Malachite green,MG)残留的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,LMG-McAb最佳稀释倍数为1∶80 000,包被抗原最佳质量浓度为0.80μg/mL;竞争反应时的LMG理想稀释液为40%乙腈水溶液;标准曲线呈线性相关,相关系数R2=0.9823,最适检测范围1 ng/mL^256 ng/mL,最低检测限为1.29 ng/mL,批内和批间变异系数分别为4.307%和4.566%;鳗鱼肉样的平均添加回收率为90%~110%;该检测方法与隐性结晶紫、孔雀石绿、结晶紫的交叉反应(CR%)分别为40.67%、13.50%和5.89%,与其他抗生素无交叉反应。

β2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

【目的】建立β2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法,为动物食源性β2-受体激动剂类药物残留的快速检测提供技术支持。【方法】以沙丁胺醇多克隆抗体为基础,优化间接竞争ELISA的检测条件,建立一种快速检测猪尿中沙丁胺醇、卡布特罗、西布特罗、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、克伦潘特、可尔特罗、吡布特罗、马喷特罗、比托特罗与妥布特罗等12种β2-受体激动剂类药物的间接竞争ELISA检测方法。【结果】建立的β2-受体激动剂类药物间接竞争ELISA检测方法的最佳反应条件为:37℃,抗原以1∶10000倍包被1 h,抗体以1∶40000稀释作用40 min,酶标抗体以1∶20000稀释作用40 min。采用建立的间接竞争ELISA最佳反应条件对猪尿中的β2-受体激动剂类药物残留进行检测,结果表明12种β2-受体激动剂类药物在0.1~20μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.952;检出限为0.15μg/L,定量限为0.5μg/L;在0.5与1.0μg/L的添加浓度下,回收率为68.4%~114.2%,批内、批间RSD分别为0.4%~10.1%和0.4%~12.5%。【结论】所建立的β2-受体激动剂类药物残留ELISA检测方法操作简单、快速,灵敏度高,适用于猪尿中β2-受体激动剂药物的筛选与检测。

检测牛乳中三聚氰胺的间接竞争ELISA方法的建立

利用戊二醛法合成的三聚氰胺—钥孔匙锥蓝蛋白(KLH)为免疫原制得三聚氰胺的多克隆抗体,并在此基础上以重氮法制备的三聚氰胺—牛血清白蛋白为包被抗原建立了检测三聚氰胺的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,理想的包被抗原质量浓度为0.8mg/L,抗三聚氰胺抗血清的稀释倍数为1:400,最适检测范围为0.03-10mg/L,最小检测量为0.01mg/L,批内与批间变异系数分别为1.952%和6.673%,回归方程为y=-0.4239-0.0933。本实验建立的三聚氰胺含量的间接竞争酶联免疫吸附试验(ci-ELISA)方法可用于牛乳样品中三聚氰胺残留的检测。

伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用

以人工合成的抗原OVA-FB1作为包被抗原,FB1（伏马菌素B1）为竞争抗原,两者与一定量的抗FB1单抗反应,建立检测FB1的间接竞争ELISA方法,对玉米样品进行初步检测应用。结果表明,间接竞争ELISA方法最佳抗原包被浓度为196 ng/ml,包被时间为4℃过夜,单抗最佳工作浓度为1∶4 000,酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 500,最佳的抗原抗体竞争反应时间和温度为4℃过夜作用。可测最适范围为10-1 000 ng/ml,回归方程为y=1.113-0.313x,相关系数R^2为-0.990,灵敏度为90.88 ng/nl,最低检测限为7.83 ng/ml,批内和批间变异系数分别为3.24%和2.45%,平均添加回收率为94.32%。

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件:最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。

环丙沙星间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法的建立

目的：建立环丙沙星残留的间接竞争ELISA检测方法。方法：用卵清白蛋白与环丙沙星偶联物做包被抗原,标准环丙沙星做竞争抗原,建立间接竞争ELISA方法,并用数学方法对结果进行了分析。结果：所建立的ELISA检测方法,最低检测限为2.77 ng/ml,检测范围为2.77～500 ng/ml。曲线回归方程为Y=-36.458X＋110.98,相关系数r2=0.9946。结论：该ELISA方法可以用于环丙沙星残留的快速检测。