鸭瘟病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的研制

将鸭瘟病毒(DPV)CHv株经过鸭胚成纤维细胞增殖、反复冻融、差速离心和蔗糖密度介质离心制备纯化抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法,并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件,研制了相应的检测试剂盒并对盒内各组分的保存条件、质量控制以及试剂盒的特异性、重复性进行了研究。结果显示,4.75μg/孔的纯化DPV抗原包被反应板可获得良好的特异性和敏感性,1∶100稀释的待检血清样品反应后D405 nm值换算为抗体效价的标准直线方程为y=1.573+3.552x(r=0.953,n=40)。试剂盒在4℃保存3个月或-20℃保存10个月后各项性能都很好。应用该试剂盒对皮下注射、口服和滴鼻免疫DPV弱毒的20日龄樱桃谷鸭血液中抗DPV特异性IgG抗体效价进行了测定,皮下免疫鸭于第6 d,口服和滴鼻免疫鸭于第9 d可在血清中检测到DPV特异性抗体,且至第60 d时依然可检测到高效价抗体。证实,该试剂盒可用于鸭瘟的血清流行病学调查和鸭场免疫抗体水平的监测。

鸡传染性法氏囊病间接ELISA诊断试剂盒的研制及初步应用

采用 vero细胞增殖的 IBDV抗原建立了间接 EL ISA,用于定量检测 IBDV抗体。对该方法进行了标准化研究 ,确立了该方法的最佳工作条件。在此基础上研制了相应的诊断试剂盒 ,并对盒内各组分的性状、保存、质量控制以及诊断试剂盒的特异性、敏感性、可重复性、符合率、与国外同类产品的比较、保存期等进行了全面、详细的研究。结果表明 ,研制的试剂盒在 - 2 0℃保存至 6个月时各项性能都很好。该试剂盒与进口试剂盒对同样血清样品检测 ,符合率为86 .7%。间接 EL ISA试剂盒与琼扩试验的符合率为 92 .5 %。该试剂盒可对大量血清样品进行检测 ,操作简单方便、结果特异性强、敏感性高、快速 ,更适合于大型鸡场 IBD免疫抗体水平的监测及现地疫病诊断等需要。

苏丹红Ⅰ直接竞争ELISA检测试剂盒的研制

直接包被多克隆抗体建立了苏丹红ⅠELISA检测技术,研制苏丹红ⅠELISA检测试剂盒。结果表明,制备的多克隆抗体对苏丹红Ⅰ亲合力强、特异性高,试剂盒标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1.55～100μg/L,50%抑制率(IC50)为13.52μg/L,灵敏度(IC10)为1.95μg/L,平均批内与批间变异系数分别为7.6%与10.6%,与苏丹红Ⅱ、Ⅲ的交叉反应率分别为4.40%和1.70%,与苏丹红Ⅳ及其他违禁食品染色剂交叉反应率低于0.01%;干辣椒、辣椒粉、辣椒油与辣椒酱等4种样品的苏丹红平均添加回收率分别为88.1%、91.4%、78.2%和84.3%,最低检测限分别为1.82、1.71、2.19和2.12μg/kg;与HPLC检测方法具有较高的相符性,4种样品相关系数分别为0.95,0.94,0.86和0.87;该试剂盒在4℃下至少可保存180d,可用于辣椒及其制品中苏丹红Ⅰ的批量快速低成本筛查。

抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制

利用合成的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通过细胞融合技术和间接竞争ELISA筛选出了能分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以此为基础研制恩诺沙星残留检测的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit),并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01%,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。

甲胺磷残留检测直接竞争ELISA试剂盒的研制

研制了一种用于检测蔬菜中甲胺磷残留量的直接竞争酶联免疫测定(ELISA)试剂盒,结果表明,该试剂盒的最低检测限为0.01μg/mL,线性检测范围为0.01μg/mL￣100μg/mL,标准曲线的平均板内变异系数为4.05%,板间平均变异系数为13.66%,回收率的范围在93.12%￣102%。试剂盒在4℃下至少可以保存6个月以上。

抗链霉素杂交瘤细胞株的建立与竞争ELISA试剂盒的研制

制备牛血清白蛋白-链霉素(SM-BSA)免疫Balb／c小鼠,用细胞融合技术制备抗链霉索单克隆抗体(SM mAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SM mAb。依据竞争ELISA原理,应用SM mAb研制SM快速ELISA检测试剂盒(SM-Kit),并对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等进行检测。结果表明,SM-Kit标准曲线呈典型的S型,线性检测范围为1～128μg／L,相关系数R2=0．925 1,灵敏度为0．45μg／L,半数抑制浓度(IC50)为7．76μg／L,检测限为1μg／L;奶样、猪尿样的平均添加回收率分别为104．45％和84．1％;SM-Kit与双氢链霉素的交叉反应率(CR)为104．16％,与其他抗生素类药物的CR<0．001％;基质对SM-Kit的检测结果影响不大。可见SM-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于SM残留的快速检测,具有较高的推广应用价值。

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。

氯霉素残留检测竞争ELISA试剂盒的研制及其性能测定

应用抗氯霉素单克隆抗体（CAP mAb）杂交瘤细胞株建立竞争ELISA（ciELISA）分析方法，研制出CAP残留快速榆测试剂盒（CAP—Kit），并对其性能进行了测定。结果表明，CAP—Kit标准曲线呈典型的S型，符合4参数logit曲线拟合，相关系数R^2=0．9955，检测范围为0．1～128．0μg·L^-1，半数抑制浓度（IC50）为2．4μg·L^-1，灵敏度为0．053μg·L^-1，检测限为0．1μg·L^-1；奶样、肉样的平均添加回收率为88．5％、82．7％，平均批内和批间变异系数均〈15％；CAP—Kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应（CR％）为150％，与其他酰胺醇类和抗菌药物无CR；基质对CAP—Kit的检测结果影响不大；CAP—Kit在4C可保存6个月以上。

REV重组env蛋白间接ELISA诊断试剂盒的研制

以纯化的env蛋白为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA(ienv-ELISA)方法。ienv-ELISA工作条件优化结果表明,最佳包被液为CB;最佳封闭液浓度为1%BSA-PBS;最佳抗原包被量为8μg/mL;血清最佳稀释度为1∶300;血清最佳作用时间为1 h;二抗的最佳稀释度为1∶5000;二抗最佳作用时间为1 h;底物最佳显色时间为25 min。重复性试验、特异性试验和对比试验结果显示,建立的ienv-ELISA方法有良好的可重复性,标准差均小于15%;与鸡MDV、ALV、NDV、H5N1、H9N1等病毒阳性抗体均无交叉反应;与REV抗体检测试剂盒(以REV全病毒为包被抗原)对比,所建立的ienv-ELISA诊断敏感性、诊断特异性以及准确率分别为90.625%9、3.75%和92.7%。

研制的间接N-ELISA试剂盒对血清样品IBV抗体的检测和分析

采用课题组研制的间接N-ELISA试剂盒与商品试剂盒对来自广西不同鸡群的393份临床血清样品进行IBV抗体检测与比较。结果表明,间接N-ELISA试剂盒与商品试剂盒IBV抗体检测结果高度吻合,而且检测结果能很好地反映不同IBV疫苗免疫后抗体产生的规律,对实际生产中鸡群IBV疫苗免疫效果的监测具有重要的指导意义。

5种布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒的比较

为提高布鲁氏菌病检测诊断能力,采用5种布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)试剂盒对背景清楚的166份牛、羊、猪血清样本进行检测,同时以试管凝集试验(SAT)作为参照方法,测定5种试剂盒的敏感性、特异性、Youden指数及AUC值等参数。结果显示,5种试剂盒的敏感性为88.00%~100.00%;特异性为86.21%~99.14%;Youden指数为86.21%~95.69%;AUC值为0.931~0.978;McNemar检验结果显示,5种试剂盒中厂家A、C和E检验结果与SAT结果差异不显著(P>0.05),厂家B和D检验结果与SAT结果差异显著(P<0.05);Kappa一致性检验分析表明,5种试剂盒与SAT结果均有高度的一致性(0.790~0.930);成本-效果分析表明,5种试剂盒优先选择依次为A、C、B、E、D。本试验结果为诊断用试剂盒选择提供参考,从而提高诊断准确性。

食品总铬质量浓度icELISA试剂盒的研制及初步应用

为研制食品中总铬质量浓度检测间接竞争ELISA(icELISA)试剂盒(Cr-Kit)。利用蛋白质连接技术合成免疫原Cr^(3+)-iEDTA-BSA,紫外扫描(UV)和电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)进行鉴定;用Cr^(3+)-iEDTA-BSA免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术筛选抗Cr^(3+)-EDTA mAb细胞株,体内诱生腹水法制备Cr^(3+)-EDTA mAb,并对其特性进行分析;应用Cr^(3+)-EDTA mAb研制Cr-Kit,测定其性能并进行初步应用。结果表明,免疫原制备成功,Cr^(3+)-iEDTA-BSA中Cr^(3+)和BSA的质量浓度分别为140.8mg/L和5.81g/L;筛选出2A3C11、2A3D9、2A11G5共3株杂交瘤细胞株,其中2A11G5最好,经6次传代分泌抗体稳定,亲和常数(Ka)为2.69×109 L/mol,与其他重金属离子无交叉反应;Cr-Kit标准曲线的线性范围为1.0~264μg/L,检测限为1.0μg/L,IC50为8.37μg/L,河水样、大米样、面粉样和猪肉样的平均加标回收率分别为101.7%、96.47%、95.8%和84.3%,Cr-Kit与国标(GB5009.123-2014)石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)的符合率为100%。本研究成功研制了Cr-Kit,可满足食品总铬残留的检测要求。

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

利用纯化的重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为检测抗原,建立一种间接ELISA方法用于血清抗体检测。昆虫细胞株(Sf-21)接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化,制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7%左右;Ni2+亲和层析柱纯化获得重组蛋白纯度为90.1%;重组蛋白可被特异性抗体识别,具有良好的免疫活性。用建立的ELISA法对30份已知阴性血清样本检测临界OD405nm值为0.343;ELISA与IPMA对150份血清进行平行检测符合率为95.3%,特异性为91.2%,敏感性为96.5%;与其他几种常见猪病毒参考血清无交叉反应。组装的试剂盒批内和批间变异系数分别为4.0%～4.8%和8.9%～9.9%;置-20℃保存12个月稳定。试剂盒对人工感染猪血清检测结果,接种后第5周抗体阳转,第8周～9周抗体水平达到高峰;对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6%。研制的ELISA试剂盒为临床PCV2血清抗体检测及疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制及应用

本研究采用EDC法人工合成链霉素抗原（SM—BSA），免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术获得了分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了快速检测链霉素（SM）残留的酶联免疫方法，并成功研制了试剂盒。然后对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等技术指标进行检测，同时应用该试剂盒对生长猪尿液中的残留情况进行检测。结果表明：除双氢链霉素外，该试剂盒与其它抗生素类药物均无交叉反应；线性检测范围为1～1289g／L，相关系数R^2=0．9251，灵敏度为0．45μg／L，半数抑制浓度（IC50）为7．769g／L，检测限为19g／L；猪尿样的平均添加回收率为84．1％；基质对该试剂盒的检测结果影响不大。该试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合于SM残留的快速检测，具有较高的推广应用价值。

用二种ELISA法进行烟草花叶病快速诊断试剂盒的研究

以改良的间接ELISA和DotELISA为基础,研制了烟草花叶病毒(TMV)快速诊断试剂盒,其中抗体最佳工作浓度为1∶5000.通过模拟田间试验条件进行检测,并与电子显微技术相互印证,经过对云南省峨山?江川等县样品的测定,结果表明试剂盒具有敏感?特异?快捷3个特点,准确率分别为100%(间接ELISA)和98.7%(DotELISA).

猪戊型肝炎ELISA诊断试剂盒的研制及应用

本试验旨在建立有效的针对猪戊型肝炎病毒(HEV)的诊断技术及试剂盒。作者建立了应用猪HEVORF3筛选出来的一段序列合成肽swHEV11检测HEV血清抗体的间接ELISA诊断方法,确定的抗原最适包被浓度为3μg·mL-1;血清最适稀释度为1∶10,作用时间为30min;酶标抗体最适稀释度为1∶12000,作用时间为60min。用HEV ORF3合成肽swHEV11研制的猪HEV ELISA诊断试剂盒,与北京万泰试剂盒检测比较,符合率为73.4%(205/279),灵敏度和特异性分别为73.3%(200/273)和83.3%(5/6)。该试剂盒批内重复的变异系数<10%,批间变异系数<20%。结果表明,该方法的建立和所研制的猪戊型肝炎诊断试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性合格,为猪戊型肝炎病毒抗体的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法。

饲料中喹乙醇ELISA检测试剂盒的研制及性能分析

本研究旨在研制快速检测饲料中喹乙醇的ELISA试剂盒(OLA-Kit)。作者用喹乙醇单克隆抗体(OLAmAb)建立间接竞争ELISA方法,组装OLA-Kit,并对试剂盒的性能进行评估。结果表明:OLA-Kit的标准曲线呈典型的反S型,相关系数R2=0.976 7,线性范围为1～243μg·L-1,半数抑制浓度(IC50)为(14.29±3.75)μg·L-1,检测限为0.79μg·L-1,定量限为4.0μg·L-1,临界值(猪饲料)为83.37μg·g-1,基质对该试剂盒的检测结果影响不大;猪、鸡、鱼饲料的不同浓度添加回收率均大于74.40%,平均批内和批间变异系数均小于15%;试剂盒与喹胺醇的交叉反应率(CR%)为17.93%,与MQCA、QCA及其他喹喔啉类药物几乎无反应性,可在2～8℃保存6个月以上;OLA-Kit与HPLC法测定猪饲料中喹乙醇添加回收率没有显著差异(P≥0.05)。本研究成功研制出敏感、特异、准确的喹乙醇ELISA检测试剂盒,可用于饲料中该药物的快速检测和批量筛查。

猪瘟间接ELISA抗体检测等2种试剂盒获批新兽药

近日，根据农业部消息，中国兽医药品监察所等8家单位申报的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒等2种兽药产品为新兽药。批准河南牧翔动物药业有限公司申报的氟苯尼考可溶性粉增加规格变更注册。