间歇性循环张力对人间充质干细胞成软骨分化的影响

目的:研究间歇性循环张力(ICMT)对人间充质干细胞(h MSCs)成软骨分化的影响。方法:取人间充质干细胞建立体外软骨分化的模型,将人间充质干细胞以8×10~4/cm^2的密度接种于被Ⅰ型胶原覆盖处理过的Bio Flex TM六孔加力板中,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,待细胞贴壁后加入成软骨诱导液培养。根据间歇性循环张力的影响分为加力组和对照组,加力组:细胞通过Flexcell FX-5000TM应变加载系统在培养箱中(37℃、5%CO_2)给予力学刺激(10%伸长率、0. 5 Hz、8 h/d)处理;对照组:不加以力学刺激放在相同环境下一起培养。两组细胞分别在加成软骨诱导液后1、3、6、8、10 d用CCK-8法检测细胞增殖。第14天用番红O染色观察细胞成软骨变化,用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用Real-time PCR的方法检测细胞成软骨基因ACAN、COLⅡ、SOX9的表达变化。结果:间歇性循环张力可以抑制间充质干细胞的增殖。第14天的加力组细胞明显凋亡,番红O染色比对照组浅,软骨基因的表达被抑制。结论:间歇性循环张力抑制人间充质干细胞成软骨分化。

中药胡椒碱在终板软骨细胞退变中的保护作用的研究

目的:探讨中药胡椒碱对椎间盘终板软骨细胞退变的保护作用。方法:分离获取大鼠终板软骨细胞,体外培养建立终板软骨细胞加力退变模型。设空白对照组(未加力细胞)、加力组(10%间歇性循环牵张力,10%ICMT,0.5 Hz,8 h/d,加力3 d)及加力加药物组(加力组中加入中药胡椒碱40μmol/L)。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型。实时聚合酶链反应检测各组细胞中SOX-9基因,II型胶原,蛋白聚糖,MMP13的表达情况,核质分离及免疫印迹检测胞核与胞质中NF-κB信号通路相关蛋白P65、p-P65表达变化。结果:细胞体外加力后表型丢失,甲苯胺蓝染色可见细胞外基质减少,加力加药组细胞外基质未见明显减少。加力组细胞(ICMT)较空白对照组细胞(NC组)SOX-9(ICMT/NC=0.22,P<0.01)、蛋白聚糖(ICMT/NC=0.15,P<0.01)、II型胶原(ICMT/NC=0.18,P<0.01)表达明显降低,NF-κB信号通路相关基因P65入核增加,NF-κB信号通路相关基因MMP13(ICMT/NC=1.68,P<0.05)表达明显上升。40μmol/L胡椒碱处理的加力加药组较加力组细胞核内p-P65减少,NF-κB信号通路相关基因MMP13(40μmol/L胡椒碱/ICMT=0.70,P<0.05)表达降低,40μmol/L胡椒碱处理的加药加力组中II型胶原(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.93,P<0.05)、蛋白聚糖(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.78,P<0.05)、SOX-9(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.70,P<0.05)等基因表达明显回升。结论:中药胡椒碱可以抑制椎间盘终板软骨细胞的退变发生,从而起到对椎间盘及终板软骨的保护作用。

淫羊藿素药物在终板软骨细胞退变中的保护作用研究

目的:探讨淫羊藿素药物对张力诱导下终板软骨细胞退变的保护作用.方法:分离获取大鼠终板软骨细胞,体外培养建立终板软骨细胞加力退变模型.设对照组(未加力的终板软骨细胞,NC组)、加力组(10%间歇性循环牵张力,10%ICMT,0.5Hz,8h/d,加力3天,ICMT组)及加力加药物组(加力组中加入不同浓度中药淫羊藿素,加药+ICMT组).倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型.MTT法检测大鼠终板软骨细胞的增殖.实时聚合酶链反应及Western blotting检测Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)及SOX-9基因变化.结果:淫羊藿素在低浓度(<2umol/L)药物范围内对大鼠终板软骨细胞生长无明显毒性作用,较高浓度对细胞生长与增殖有明显的抑制作用.终板软骨细胞体外加力后细胞表型改变,甲苯胺蓝染色可见细胞外基质减少,加药+ICMT组细胞外基质未见明显减少.淫羊藿素药物在一定药物范围内对大鼠终板软骨细胞具有保护作用,抑制细胞软骨细胞退变发生.结论:淫羊藿素通过抑制椎间盘终板软骨细胞退变的发生,进而起到保护终板软骨的作用.

骨保护素保护关节软骨细胞作用机制研究

目的探讨骨保护素(OPG)对间歇性循环牵张力(ICMT)加力诱导下退变的关节软骨细胞保护作用的机制。方法获取大鼠膝关节软骨细胞,传代至P2代进行实验,对细胞用FX-5000TM细胞体外力学刺激装置进行力学刺激,建立关节软骨细胞体外退变模型。P2代软骨细胞随机分为对照组、ICMT 3 d组(在与对照组相同培养条件下对细胞进行8%压强的ICMT,0.5 Hz,10 h/d,加力3 d)、OPG组(在细胞培养液中加入一定浓度的OPG培养细胞)、ICMT 3 d+OPG组(对用含有OPG的细胞培养液培养的细胞进行加力3 d)。培养3 d后收集各组细胞,应用倒置相差光学显微镜观察关节软骨细胞的表型变化,甲苯胺蓝染色法观察细胞表面形态,四噻唑蓝法检测不同浓度OPG和不同ICMT作用时间下关节软骨细胞存活率的变化。RT-PCR法检测各组关节软骨细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX-9)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)mRNA表达水平,Western blot法检测各组关节软骨细胞中NF-κB信号通路相关蛋白MMP-13、p65、磷酸化p65(p-p65)蛋白表达水平。结果与对照组比较,ICMT 3 d组细胞发生梭形改变,细胞外基质减少;ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞形态变化不明显,细胞外基质的丢失得到改善。ICMT 1 d组、ICMT 2 d组、ICMT 3 d组、5 ng OPG组、10 ng OPG组和20 ng OPG组与对照组关节软骨细胞存活率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较,ICMT 1 d组、ICMT 3 d组细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表达水平均下降,ICMT 3 d组细胞中MMP-13 mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+10 ng OPG组细胞中二型胶原、SOX-9 mRNA表达水平均升高,ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表达水平均升高,ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞中MMP-13 mRNA表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+5 ng OPG组、ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组MMP-13蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组中p-p65蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。结论OPG通过影响NF-κB信号通路可以抑制大鼠膝关节软骨细胞的退变,从而起到保护关节软骨的作用。