间歇性循环张力对人间充质干细胞成软骨分化的影响

目的:研究间歇性循环张力(ICMT)对人间充质干细胞(h MSCs)成软骨分化的影响。方法:取人间充质干细胞建立体外软骨分化的模型,将人间充质干细胞以8×10~4/cm^2的密度接种于被Ⅰ型胶原覆盖处理过的Bio Flex TM六孔加力板中,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,待细胞贴壁后加入成软骨诱导液培养。根据间歇性循环张力的影响分为加力组和对照组,加力组:细胞通过Flexcell FX-5000TM应变加载系统在培养箱中(37℃、5%CO_2)给予力学刺激(10%伸长率、0. 5 Hz、8 h/d)处理;对照组:不加以力学刺激放在相同环境下一起培养。两组细胞分别在加成软骨诱导液后1、3、6、8、10 d用CCK-8法检测细胞增殖。第14天用番红O染色观察细胞成软骨变化,用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用Real-time PCR的方法检测细胞成软骨基因ACAN、COLⅡ、SOX9的表达变化。结果:间歇性循环张力可以抑制间充质干细胞的增殖。第14天的加力组细胞明显凋亡,番红O染色比对照组浅,软骨基因的表达被抑制。结论:间歇性循环张力抑制人间充质干细胞成软骨分化。

周期性牵张力对人牙周膜细胞中成骨样细胞表型碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达的影响

目的 :了解机械力介导的牙周膜细胞中成骨样细胞特性的改变 ,以利于深入研究正畸牙齿移动的机制。方法 :应用地高辛标记寡核苷酸探针进行细胞原位杂交 ,检测在间歇性机械牵张力作用下人牙周膜细胞中的成骨样细胞表型蛋白碱性磷酸酶和骨钙素在mRNA转录水平的表达改变。结果 :间歇性牵张力作用增强人牙周膜细胞碱性磷酸酶和骨钙素基因的表达。结论

中药胡椒碱在终板软骨细胞退变中的保护作用的研究

目的:探讨中药胡椒碱对椎间盘终板软骨细胞退变的保护作用。方法:分离获取大鼠终板软骨细胞,体外培养建立终板软骨细胞加力退变模型。设空白对照组(未加力细胞)、加力组(10%间歇性循环牵张力,10%ICMT,0.5 Hz,8 h/d,加力3 d)及加力加药物组(加力组中加入中药胡椒碱40μmol/L)。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型。实时聚合酶链反应检测各组细胞中SOX-9基因,II型胶原,蛋白聚糖,MMP13的表达情况,核质分离及免疫印迹检测胞核与胞质中NF-κB信号通路相关蛋白P65、p-P65表达变化。结果:细胞体外加力后表型丢失,甲苯胺蓝染色可见细胞外基质减少,加力加药组细胞外基质未见明显减少。加力组细胞(ICMT)较空白对照组细胞(NC组)SOX-9(ICMT/NC=0.22,P<0.01)、蛋白聚糖(ICMT/NC=0.15,P<0.01)、II型胶原(ICMT/NC=0.18,P<0.01)表达明显降低,NF-κB信号通路相关基因P65入核增加,NF-κB信号通路相关基因MMP13(ICMT/NC=1.68,P<0.05)表达明显上升。40μmol/L胡椒碱处理的加力加药组较加力组细胞核内p-P65减少,NF-κB信号通路相关基因MMP13(40μmol/L胡椒碱/ICMT=0.70,P<0.05)表达降低,40μmol/L胡椒碱处理的加药加力组中II型胶原(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.93,P<0.05)、蛋白聚糖(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.78,P<0.05)、SOX-9(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.70,P<0.05)等基因表达明显回升。结论:中药胡椒碱可以抑制椎间盘终板软骨细胞的退变发生,从而起到对椎间盘及终板软骨的保护作用。

淫羊藿素药物在终板软骨细胞退变中的保护作用研究

目的:探讨淫羊藿素药物对张力诱导下终板软骨细胞退变的保护作用.方法:分离获取大鼠终板软骨细胞,体外培养建立终板软骨细胞加力退变模型.设对照组(未加力的终板软骨细胞,NC组)、加力组(10%间歇性循环牵张力,10%ICMT,0.5Hz,8h/d,加力3天,ICMT组)及加力加药物组(加力组中加入不同浓度中药淫羊藿素,加药+ICMT组).倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型.MTT法检测大鼠终板软骨细胞的增殖.实时聚合酶链反应及Western blotting检测Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)及SOX-9基因变化.结果:淫羊藿素在低浓度(<2umol/L)药物范围内对大鼠终板软骨细胞生长无明显毒性作用,较高浓度对细胞生长与增殖有明显的抑制作用.终板软骨细胞体外加力后细胞表型改变,甲苯胺蓝染色可见细胞外基质减少,加药+ICMT组细胞外基质未见明显减少.淫羊藿素药物在一定药物范围内对大鼠终板软骨细胞具有保护作用,抑制细胞软骨细胞退变发生.结论:淫羊藿素通过抑制椎间盘终板软骨细胞退变的发生,进而起到保护终板软骨的作用.

骨保护素保护关节软骨细胞作用机制研究

目的探讨骨保护素(OPG)对间歇性循环牵张力(ICMT)加力诱导下退变的关节软骨细胞保护作用的机制。方法获取大鼠膝关节软骨细胞,传代至P2代进行实验,对细胞用FX-5000TM细胞体外力学刺激装置进行力学刺激,建立关节软骨细胞体外退变模型。P2代软骨细胞随机分为对照组、ICMT 3 d组(在与对照组相同培养条件下对细胞进行8%压强的ICMT,0.5 Hz,10 h/d,加力3 d)、OPG组(在细胞培养液中加入一定浓度的OPG培养细胞)、ICMT 3 d+OPG组(对用含有OPG的细胞培养液培养的细胞进行加力3 d)。培养3 d后收集各组细胞,应用倒置相差光学显微镜观察关节软骨细胞的表型变化,甲苯胺蓝染色法观察细胞表面形态,四噻唑蓝法检测不同浓度OPG和不同ICMT作用时间下关节软骨细胞存活率的变化。RT-PCR法检测各组关节软骨细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX-9)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)mRNA表达水平,Western blot法检测各组关节软骨细胞中NF-κB信号通路相关蛋白MMP-13、p65、磷酸化p65(p-p65)蛋白表达水平。结果与对照组比较,ICMT 3 d组细胞发生梭形改变,细胞外基质减少;ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞形态变化不明显,细胞外基质的丢失得到改善。ICMT 1 d组、ICMT 2 d组、ICMT 3 d组、5 ng OPG组、10 ng OPG组和20 ng OPG组与对照组关节软骨细胞存活率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较,ICMT 1 d组、ICMT 3 d组细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表达水平均下降,ICMT 3 d组细胞中MMP-13 mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+10 ng OPG组细胞中二型胶原、SOX-9 mRNA表达水平均升高,ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表达水平均升高,ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞中MMP-13 mRNA表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+5 ng OPG组、ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组MMP-13蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组中p-p65蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。结论OPG通过影响NF-κB信号通路可以抑制大鼠膝关节软骨细胞的退变,从而起到保护关节软骨的作用。