参芪液对成人骨髓间质干细胞的诱导分化作用

目的 探讨参芪液体外对成人骨髓间质干细胞 (MSC)定向诱导分化为神经元的作用。方法 从成人肋骨分离MSC ,体外培养扩增 ,并传代至第 5代。含 10mg/mL碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的培养液预诱导 2 4h ,再用含不同浓度参芪液的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果 成人骨髓间质干细胞在体外扩增 5代后 ,加入参芪液诱导 ,可见MSC胞体收缩 ,突起伸出。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性 ,GFAP阴性。神经分化的定量分析显示NSE、NF阳性细胞分别为 (79 5± 2 5 ) %和 (76 5± 2 3 ) %。

骨髓间质干细胞移植治疗DMD模型鼠的肌组织dystrophin/utrophin表达

目的观察骨髓间质干细胞(MSC)移植治疗Duchenne肌营养不良症(DMD)动物模型dko小鼠后肌组织dystrophin/utrophin的表达情况。方法用体外培养纯化的第5代MSC经尾静脉移植治疗dko小鼠,移植后5、10、15、20周分别取实验鼠腓肠肌组织做荧光免疫组化检测dystrophin/utrophin的表达,计算阳性纤维的平均光密度。结果传3代以上呈集落生长的MSC均一性好,静脉移植免疫反应低。移植后5～20周dko小鼠肌膜组织dystrophin/utrophin免疫荧光表达强度有随着时间逐渐递增的趋势,移植15周前后肌膜荧光带光密度有显著性差异(P=0.035)。结论MSC在体内外均具有强大的可塑性,通过血液循环MSC可趋向病变肌组织,并分化为表达dystrophin/utrophin的肌纤维,干细胞移植对dko小鼠肌萎缩组织有一定修复作用。

骨髓间质干细胞输注对庆大霉素致急性肾小管损伤细胞增殖和凋亡的影响

目的观察骨髓间质干细胞(MSCs)对庆大霉素导致的急性肾功能衰竭(ARF)的疗效,并探讨其可能的机制。方法建立庆大霉素皮下注射致大鼠ARF模型。雄性SD大鼠MSCs用4,6-二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)标记。雌性SD大鼠随机分为对照组(C组)、MSCs组(M组)和DMEM-F12组(D组)。C组未给予任何处理;M组在每次给予庆大霉素的同时经尾静脉静注DAPI标记的MSCs;D组在每次给予庆大霉素的同时注入无血清DMEM-F12。7d后观察血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)以及肾脏病理改变(HSK评分),采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数(AI),免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、Fas/FasL的表达,并观察DAPI标记的MSCs在受体大鼠肾脏的分布情况。结果M组的HSK评分、BUN、Scr(分别为5.5±0.8、11.6±2.2mmol/L、93.5±13.1μmol/L)均低于D组(分别为10.2±0.8、22.2±6.3mmol/L、204.4±53.1μmol/L,P<0.05);M组肾小管上皮细胞PCNA+细胞数、AI(分别为20.8%±3.7%、15.73%±2.43%)低于D组(分别为42.1%±5.2%、23.76%±4.30%,P<0.05)。M组Bcl-2表达(35.27%±2.93%)高于D组(25.28%±3.10%,P<0.05);M组Fas、FasL(分别为21.53%±3.72%、20.50%±3.71%)均低于D组(37.28%±11.14%、37.66%±10.59%,P<0.05)。整个实验期间未发现MSCs定位于肾组织中。结论外源性MSCs可以促进ARF损伤后肾小管上皮细胞的增殖并减少细胞凋亡,促进Bcl-2和抑制Fas/FasL表达,从而有利于肾小管损伤的早期恢复。

间充质干细胞经MyoD转染诱导为成肌细胞后对肌损伤的修复作用

目的观察间充质干细胞(MSCs)被MyoD转染诱导为成肌细胞后对肌损伤的修复作用并探讨其机制。方法160只SCID小鼠随机分为正常组、致伤对照组、MSCs组和成肌细胞组,每组40只。将真核表达双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD转染MSCs,使MSCs分化诱导为成肌细胞,将MSCs和成肌细胞分别植入Cardiotoxin造成的小鼠损伤肌组织中,1、2、4、6周后观察肌损伤修复效果。结果成功制作了肌损伤模型,MSCs和成肌细胞对肌损伤均有促进修复作用,以成肌细胞效果显著,成肌细胞组肌肉组织抗牵引力强于MSCs组。Western blotting结果表明,修复过程中成肌细胞组MyoD表达显著高于MSCs组、损伤对照组和正常组,成肌细胞组1周时JNK1、ERK2表达显著增加,p38表达显著减少,但6周时与正常组比较均无显著差异。结论MSCs被MyoD转染诱导后形成的成肌细胞能有效修复肌损伤,JNK1、p38及ERK2在修复中起重要作用。

大鼠骨髓间质干细胞静脉移植在脊髓损伤中的定向迁移

目的观察大鼠骨髓间质干细胞(ratbonemarrowstromalcells,rMSCs)静脉移植在体内的定向迁移。方法分离培养rMSCs,流式细胞术检测其表面标志,运用改良Allen法制备大鼠T10脊髓损伤模型,随机分为假手术组、对照组、rMSCs静脉移植组。假手术组、rMSCs静脉移植组同时于大鼠损伤后72小时经尾静脉移植溴脱氧尿苷(BrdU)标记MSCs。免疫组化技术检测rMSCs在体内迁移、存活以及分化情况。结果rMSCs体外分离培养扩增5代,细胞数可达1～2×1011个,具有多态性和贴壁生长特性,流式细胞术检测CD34、CD45阴性,CD29、CD90表达阳性。移植的rMSCs在宿主损伤脊髓中聚集并存活,3～5W后即有部分移植细胞表达神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)、神经丝蛋白(neurofilament,NF)、微管相关蛋白(microtubuleassociatedprotein2,MAP2)。结论rMSCs体外扩增迅速,具有干细胞特性,经静脉移植在宿主体内可向损伤区脊髓聚集存活分化。

骨髓间质干细胞移植治疗大鼠实验性肺动脉高压

目的探讨骨髓间质干细胞（MMSC）移植治疗肺动脉高压（PAH）的疗效和机制。方法体外分离培养SD大鼠骨髓MMSC，以Hoechst 33342荧光染料标记。80只SD大鼠随机分为PAH组（30只）、PAH＋MMSC移植组（移植组，30只）和正常对照组（对照组，20只）。采用一次性注射野百合碱50mg／kg的方法制备PAH模型。移植组于建模第22天舌下静脉注射5×10^6／ml的MMSC细胞悬液1ml，其他2组同时间注射等量细胞培养液。饲养4周，观察各组大鼠一般情况计算生存率。实验第21天每组各处死4只大鼠，实验第49天处死所有存活大鼠，测定肺动脉平均压（mPAP）、右心室肥大指数，并取肺组织做肺小动脉形态计量学指标检测、血管Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色和微血管密度分析。结果实验结束时PAH组和移植组大鼠生存率分别为50％（15／30）和90％（27／30，P〈0．01）。第21天PAH组和移植组mPAP分别为（39．1±2．5）和（38．5±2．1）mmHg（1mmHg=0．133kPa）；右心室肥大指数分别为（34．0±3．1）％和（33．8±2．6）％，均明显高于对照组[（15．2±1．7）mtnHg，（22．7±1．5）％，均P〈0．01）]。第49天，PAH组和移植组mPAP分别为（42．7±2．3）和（24．7±2．1）mmHg，右心室肥大指数分别为（45．1±3．4）％和（38．8±3．2）％，移植组均明显低于PAH组（均P〈0．01）；与PAH组比较，移植组肺小动脉形态计量学指标明显改善。荧光显微镜观察显示荧光标记MMSC在肺内定植且分化成大量新生血管并形成侧支循环，肺动脉重构得到有效逆转。免疫组组织化学染色观察证实移植组大鼠肺组织中有大量新生血管形成，微血管密度明显高于PAH组[（5．2±0．8）比（1．4±0．5）个／高倍视野，P〈0．01]。结论MMSC移植可通过分化形成新生血管和修复损伤肺小动脉，逆转肺血管重构，降低肺动脉压，有效减轻甚至是逆转野百合碱诱导的PAH进程。

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化

目的观察不同条件下骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导分化为肾小管上皮样细胞的差异。方法抽取SD大鼠的骨髓，经密度梯度离心分离，联合贴壁筛选法获取纯化的MSC。以流式细胞仪鉴定间充质干细胞表面标志。取扩增3代的MSC分组培养：（1）对照组：用含胎牛血清培养基；（2）全反式维甲酸（ATRA）组：胎牛血清＋缺血再灌注肾脏匀浆上清＋ATRA；（3）联合诱导组：胎牛血清＋缺血再灌注肾脏匀浆上清＋ATRA＋表皮生长因子（EGF）＋骨形成蛋白（BMP．7）。诱导7d后，倒置显微镜下观察细胞形态变化；化学染色检测细胞碱性磷酸酶表达；免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18（cytokeratin-18）、E钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。结果流式细胞仪显示，体外分离培养的第3代MSC，CD44阳性细胞表达率为97．8％±0．9％；CD90阳性细胞表达率为96．8％±1．4％；CD29阳性细胞表达率为97．6％±2．4％；而CD11b／c阳性细胞表达率为13．2％±0．6％；CD34阳性细胞表达率为1．2％±0．5％。诱导7d后，与对照组长梭形细胞相比，ATRA组部分细胞为圆形、短梭形单层排列；联合诱导组的大部分细胞为圆形、短梭形，细胞密集处呈鹅卵石样排列。碱性磷酸酶染色显示，对照组细胞为阴性；ATRA组部分细胞阳性；联合诱导组阳性细胞数明显增多。免疫细胞化学显示，ATRA组和联合诱导组细胞cytokeratin-18阳性表达率分别为29．47％±1．08％和47．52％＋2．13％，显著高于对照组（P〈0．05）；E-cadherin阳性表达率分别为14．88％±2．46％和36．15％±1．13％，也显著高于对照组（P〈0．05）。结论在体外模拟的急性肾衰竭微环境中加入ATRA可诱导MSC部分分化为肾小管上皮样细胞。联合EGF、BMP-7共同诱导能进一步促进MSC向肾小管上皮样细胞分化。

骨髓间充质干细胞移植对MRL／lpr鼠B细胞活化因子及B细胞活化的影响

目的探讨正常鼠骨髓间充质干细胞（BM—MSCs）移植对MRI/lpr狼疮鼠B细胞活化因子（BAFF）表达及B细胞活化的影响。方法18只雌性MRL／lpr鼠随机分为MSCs治疗组和对照组，18周龄时治疗组经尾静脉移植MSCs 1×l0^6／只；5只同周龄雌性BALB／C小鼠作为健康阴性对照。酶联免疫吸附试验（EuSA）法检测血清BAFF、干扰素（IFN）-γ、向细胞介素（IL）-2、IL-10水平，流式细胞术检测脾脏中边缘区、T1期、T2期B细胞百分率及细胞数。结果①MSCs治疗8周后，治疗组血清BAFF水平[（32±14）ng／ml]显著低于对照组[（47±13）ng／ml]（P〈0．05）；血清IL-10[（19±7）pg／ml]显著低于对照组[（40±13）pg／ml]（P〈0．01）；血清IFN-γ、IL-2低于对照组[（26±20）pg／ml与（38±25）pg／ml、（73±10）pg／ml与（80±14）pg／ml]，但差异无统计学意义。②MSCs治疗8周后，可降低治疗组脾脏边缘区B细胞百分率（15±4）％，对照组为（21±5）％，但差异无统计学意义，并能显著降低边缘区B细胞数[（9±6）×10s与（19±10）x106；p〈0．0530③MSCs治疗8周后，可降低治疗组脾脏T1期、T2期B细胞百分率[（3．4±2．1）％与（7．3±4．0）％]、[（2．6＋1．4）％与（4．8-＋2．7）％]，但差异无统计学意义，并能显著降低T1期B细胞绝对数[（2．7±1．7）×10^6与（5．1±2．0）×10^6 P〈0．05]、T2期B细胞绝对数[（2．0±1．2）×10^6与（3．7±1．7）×10^6,P〈0．0530结论BM—MSCs移植可能通过抑制体内BAFF的过量表达，进而抑制狼疮鼠B细胞的过度活化。