自体骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤疗效观察

目的:观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤患者的近期疗效及其安全性。方法:选择2005-04/2006-02在山东省残疾人康复中心住院的脊髓损伤患者24例,采用随机表法分为治疗组和对照组。患者知情同意并签署知情同意书。治疗组11例,对照组13例,均经CT或MRI确诊并行手术治疗。两组在年龄、病程、损伤程度(ASIA分级)等方面均具有可比性(P>0.05)。治疗组在综合康复治疗的基础上给予自体骨髓间充质干细胞治疗,经髂骨穿刺采集自体骨髓156～180mL,分离提取骨髓间充质干细胞后经静脉途径和/或蛛网膜下腔1次性或分次注射。对照组仅给予综合康复治疗。两组均于入院当天、治疗后7,15,30,60,90d进行运动与感觉、日常生活能力、膀胱功能评定。结果:24例患者均进入结果分析。①治疗组11例患者均有不同程度的感觉、运动和自主神经功能改善,与对照组比较,差异不显著。②治疗组ASIA分级A级8例,有2例在第60天、1例在第90天评估中恢复为B级。C级1例,在第30天评估中恢复为D级,第90天评估中恢复为E级,能独立行走,生活完全自理。D级2例,其中1例在第90天评估中恢复为E级。对照组A级9例,1例在第90天评估中恢复为B级。B级1例,治疗后无变化。C级2例,1例在第90天评估中恢复为D级。③骨髓间充质干细胞移植常见的不良反应包括低热(7/11例)、头痛(2/11例)、腹胀(1/11例),其中1例于蛛网膜下腔注射后出现双下肢麻木和脑膜刺激征,均于两三天内自行消失。结论:骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤近期有一定疗效而且安全,但远期疗效有待于进一步观察。

大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇(2-ME)预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚(BHA)诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸羟化酶(TH)的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。

体外诱导人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

目的 探索在体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSC)向心肌细胞分化的方法。方法 以5 杂氮胞苷( 5 Aza)对hMSC诱导,利用结蛋白抗体、房性利钠肽抗体以及闰盘蛋白抗体进行免疫组化染色,并进行超薄切片透射电镜观察。结果 经反复多次传代后,细胞形态及抗原表达无改变,始终保持未分化状态和稳定扩增。利用5 Aza对其诱导后第2周始,免疫组化染色发现细胞结蛋白、闰盘蛋白以及房性利钠肽表达均为阳性,不同浓度5 Aza诱导组之间差异无显著性。电镜观察发现这些细胞具有心肌细胞的特点。结论 在体外利用5 Aza可以诱导hMSC向心肌细胞分化。

骨髓间充质干细胞在骨科疾病修复中的应用

目的:充分认识骨髓间充质干细胞强大的增殖能力和多向分化潜能,并将其应用于骨科系统疾病的修复治疗。资料来源:应用计算机检索Pubmed1995-01/2006-03期间与骨髓间充质干细胞的应用的相关文献,检索词为“bonemesenchymalstemcells,cartilageandbonedefectsorosteonecrosisordiscdegeneration”并限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选取有对照组的有关骨髓间充质干细胞在骨科疾病修复中研究和进展的文献,排除明显不随机的文献、综述文献和重复研究。资料提炼:共收集到45篇关于骨髓间充质干细胞治疗骨科疾病的文献,入选19篇,包含了骨髓间充质干细胞的分离和纯化、培养、鉴定以及骨髓间充质干细胞治疗骨科疾病的现状等方面的进展。排除的26篇为明显不随机的文献、综述文献或重复性文献。资料综合:①目前已建立了多种分离纯化骨髓间充质干细胞的方法,如密度梯度离心法,贴壁筛选法,流式细胞仪分选法,磁珠分选法等,现今常用数种方法相结合,以提高原代分离的效率。②骨髓间充质干细胞培养最常用的是低糖DMEM培养基,其中100g/L的胎牛血清最有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、扩增及多系潜能的维持,种植密度、氧浓度及细胞因子都对骨髓间充质干细胞的培养也有一定影响。③至今尚无明确的骨髓间充质干细胞鉴定方法,但利用骨髓间充质干细胞的一些生物学特征、表面标志物及特异性基因的表达,再借助一些实验技术,可基本达到区分它们的目的。④骨髓间充质干细胞具有来源较广、自体骨髓间充质干细胞移植,无免疫排斥反应等优点,利用骨髓间充质干细胞修复骨缺损就成为广大学者研究的一大热点。随着基因工程的兴起,不少学者把骨髓间充质干细胞作为基因治疗靶细胞,转入生长因子和细胞因子基因,进行骨缺损修复的实验研究。主要研究方向为骨、软骨缺损疾病的治疗,骨坏死疾病的治疗及椎间盘退行性疾病的治疗。结论:骨髓间充质干细胞应用于骨科疾病修复的前景广阔。但同时也面临着许多问题,如得到纯度更高的骨髓间充质干细胞,调控骨髓间充质干细胞在体内的增殖与分化,找到一种理想的骨髓间充质干细胞复合载体,保证骨髓间充质干细胞移植后的生物安全性等。

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。

霉酚酸对人骨髓来源间充质干细胞的作用

目的:研究霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)对人骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的作用及其机制。方法:在MSCs生长和分化过程中加入不同浓度的MPA,用CCK-8方法分析MSCs增殖的情况,用Annexin V/PI双染色法检测MPA各浓度组的细胞凋亡,RT-PCR方法分析MSCs次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)的表达;应用von Kossa染色、钙定量和real-time PCR方法分析MPA对MSCs成骨分化的影响。结果:1～100μmol/L的MPA呈时间浓度依赖性地抑制间充质干细胞的生长,添加鸟嘌呤核苷可以解除该抑制效应,且该抑制效应与细胞凋亡无关;RT-PCR结果显示,MSCs表达IMPDHⅠ和IMPDHⅡ两种亚型;von Kossa染色和钙定量显示,MPA抑制MSCs的成骨分化,Osteopontin和BMP-2的表达相应减低;进一步研究发现,MPA可能通过影响转录因子Runx2、Osterix的表达而影响MSCs的成骨分化。结论:MPA通过耗竭鸟嘌呤核苷的方式呈时间浓度依赖性抑制人骨髓来源的间充质干细胞的增殖;同时,MPA通过抑制Runx2和Osterix蛋白的表达,抑制MSCs的成骨分化。

肌腱干细胞与骨髓间充质干细胞促进髌腱愈合的对比研究

目的：观察肌腱干细胞（TDSC）和骨髓间充质干细胞（BMSC）对大鼠缺损髌腱的修复作用。方法：从SD大鼠的髌腱及骨髓组织中，分离出TDSC和BMSC并培养，分别联合纤维蛋白胶移植到大鼠髌腱缺损模型中。60只SD大鼠分为以下三组：TDSC组采用TDSC＋纤维蛋白胶；BMSC组采用BMSC＋纤维蛋白胶；对照组采用纤维蛋白胶。术后1、2、4、6、8周检测移植物的大体外观形态、组织学变化及生物力学指标。结果：术后8周TDSC组、BMSC组髌腱缺损基本消失，对照组仍可见髌腱缺损边界。术后8周TDSC组、BMSC组均可见类似肌腱样组织；对照组见肉芽组织增生，细胞排列紊乱，组织杂乱无序。随着时间增长各组的最大应力、最大应力百分比和弹性模量、弹性模量百分比均增加（均P〈0．05）；在各个时间点，TDSC组、BMSC组的最大应力和弹性模量均高于对照组（均P〈0．05）。在2周时，TDSC组的最大应力百分比和弹性模量百分比均高于对照组（均P〈0．05）；TDSC组、BMSC组在4、6、8周时最大应力百分比和弹性模量百分比均高于对照组（均P〈0．05），TDSC组与BMSC组差异无统计学意义（P〉0．05）。8周时，TDSC组与BMSC组的弹性模量百分比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：同种异体TDSC联合纤维蛋白胶可促进肌腱早期愈合、改善肌腱的生物力学特性，并且其弹性模量优于BMSC联合纤维蛋白胶，提示TDSC能更好地促进肌腱损伤的早期修复。

抗人间充质干细胞单克隆抗体的制备及生物学特性研究

目的:制备抗人间充质干细胞(hM SC s)的单克隆抗体,为鉴定、分选hM SC s奠定基础。方法:以多供体hM SC s免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并以间接免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞术等检测单克隆抗体在细胞及组织中的表达。结果:建立了5个能分泌抗人间充质干细胞的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该组单抗能与人间充质干细胞特异性结合,而对所检测的人间充质和非间充质来源的组织和细胞均未见交叉反应,5个单抗的相对亲和力分别为:ZUB1 1×106、ZUB4 1×105、ZUC 3 1×106、ZUE 12 1×105、ZUF10 1×105;表位分析:ZUB1、ZUE 12、ZUF10针对相同的表位,ZUC 3和ZUB4则分别针对不同的表位。流式细胞分析显示分离培养的hM SC s阳性表达率为ZUB1 87.39%、ZUB4 88.07%、ZUC 3 88.12%、ZUE 12 69.89%和ZUF10 83.67%。结论:5株杂交瘤分泌的单克隆抗体均能与人间充质干细胞发生特异性结合,为深入研究hM SC s的生物学功能奠定了基础。

基于间充质干细胞的小分子化学药物肿瘤靶向递送系统研究进展

近年来,大量研究通过细胞内化或细胞膜结合的方式将生物大分子或小分子化学药物负载于间充质干细胞(MSC)上,利用其天然的肿瘤归巢特性实现药物的靶向递送,继而通过在靶部位药物的释放或基因表达,达到肿瘤治疗的目的。基因修饰MSC的研究较为成熟,而递送小分子化学药物的研究起步较晚。本文从MSC肿瘤迁移机制、细胞注射后体内分布特点入手,总结了MSC在小分子化学药物肿瘤靶向递送中的研究;同时介绍了MSC与原型药物、载药纳米粒构建的复合系统的载药、释药过程,展望了该系统遇到的挑战和应用前景。

兔脂肪干细胞的体外成脂成骨诱导及BrdU标记情况的初步研究

目的探索兔脂肪间充质干细胞体外分离培养的方法及生物学特性,并探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记脂肪间充质干细胞的效果。方法取兔颈后脂肪采用胶原酶消化方法分离培养干细胞,诱导培养基定向成脂、成骨细胞诱导及组织化学鉴定。采用BrdU法标记干细胞,免疫组化法鉴定其体外标记情况。结果兔脂肪组织中可以分离培养出生长旺盛的干细胞,定向诱导后表现出成脂,成骨细胞的特性。BrdU可标记干细胞的核,体外标记率达95%。结论兔脂肪干细胞易于体外分离培养,具有较强的自我更新能力及多向分化的潜能。BrdU对脂肪干细胞的标记效果满意,操作简单易行。

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。

神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养的实验研究

目的探讨神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养对神经干细胞分化为神经元的影响。方法将纯化的神经干细胞和骨髓间充质干细胞混合培养，观察神经干细胞的分化状态，应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果共培养组中36.35%±4.63%的细胞表达神经元特异性蛋白NSE，明显高于对照组中12.78%±6.91%的表达率。结论骨髓间充质干细胞能提高神经干细胞分化为神经元的比例，还能延长神经元的存活时间。

增强型绿色荧光蛋白转染猪骨髓间充质干细胞特性观察

目的:借助质粒将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染猪骨髓干细胞(MSC),观察转染后EGFP在(MSC)内表达情况及MSC生长特性。方法:1月龄小型香猪为MSC供体,EGFP基因转染MSC,计算转染效率,流式细胞仪鉴定G418筛选后EGFP基因稳定表达率和转染后细胞增殖周期改变。结果:转染率为(36.9±3.4)%;G418筛选后EGFP表达率75.6%,EGFP转染MSC G0/G1期MSC比例较对照组明显增加(P<0.01),S+G2/M期MSC比例减少(P<0.01)。结论:猪MSC经基因转染和G418筛选,获得EGFP稳定表达;转染和G418筛选后MSC增殖能力降低,G0/G1期MSC比例增加,S+G2/M期MSC比例下降。