阔叶薰衣草芳樟醇合成酶基因的克隆与表达载体构建

以阔叶薰衣草(Lavandula latifolia)的鲜叶为试材,通过RT-PCR技术,获得阔叶薰衣草芳樟醇合成酶基因的cDNA序列。该序列长度为1809bp,编码602个氨基酸,包含一个1809 bp的开放阅读框,与NCBI上已公布的阔叶薰衣草的芳樟醇合成酶蛋白序列相似度为98%,有21个核苷酸差异,11个氨基酸差异,将其命名为Lslis。序列分析研究表明:Lslis具有多数单萜烯类合成酶基因典型的保守结构域,即DDXXD,RRX8W和(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE;具有芳樟醇合酶活性必需的DDXXD功能基团。Lslis推导氨基酸序列的预测分子质量和等电点分别为70.36和5.66 kD;疏水性分析结果表明其大部分氨基酸区域为亲水结构,该基因为亲水多肽。Lslis和已公布的阔叶薰衣草芳樟醇合酶Lllis的蛋白二级结构预测结果表明,两者在整体结构上基本保持一致,但Lslis相对于Lllis要少一个α螺旋结构。将其连接到pMD18-T的载体上,通过中间载体pCAMBIA1303,构建了Lslis基因的植物表达载体,并将其导入农杆菌,经菌落PCR鉴定和测序结果表明该片段已插入表达载体。

阔叶薰衣草叶片总RNA两种提取法的比较

分别采用TRIzol法和改良的CTAB法提取阔叶薰衣草叶片的RNA,并用紫外光谱和琼脂糖凝胶电泳对其提取效果进行鉴定。实验结果表明:TRIzol法提取的总RNA浓度高,但杂质较多且有部分降解、稳定性差;改良的CTAB法提取得到的总RNA的纯度较高,OD260/OD280值为1.909,效果稳定,有良好的可重复性。因此,改良的CTAB法是一种较为简便、经济的提取阔叶薰衣草叶片总RNA的方法。