阪崎克罗诺杆菌双抗夹心酶联免疫吸附检测方法的建立

为建立阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的免疫学快速检测方法,分别制备了阪崎克罗诺杆菌的特异性单抗和多抗,建立阪崎克罗诺杆菌的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA检测方法。结果:获得4株抗阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体阳性细胞株,分泌抗体效价分别是1∶128000、1∶32000、1∶256000和1∶256000,抗阪崎克罗诺杆菌兔多克隆抗体效价是1∶128000。建立的阪崎克罗诺杆菌DAS-ELISA检测方法,分别以抗阪崎克罗诺杆菌兔多抗和单抗作为捕获抗体和检测抗体,兔多抗的最佳稀释度为1∶4000,单克隆抗体最佳稀释度为1∶1000,灵敏性可达1×106 CFU/mL;该检测方法具有良好的特异性,与常见的6种食源性病原菌都没有交叉反应,且能够同时检测6种克罗诺杆菌属细菌;重复性结果显示,该检测方法的批内批间变异系数均小于15%,具有良好的重复性。综上,利用抗阪崎克罗诺杆菌的单抗和兔多抗成功建立了DAS-ELISA方法,该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可为阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供技术支撑。

鼠李糖乳酪杆菌对乳鼠肠道发育和阪崎克罗诺杆菌致坏死性肠炎的影响

为研究鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SW-02对乳鼠肠道发育的影响,将新生C57BL/6小鼠以SW-02(1×10^(7) CFU/d)灌胃,饲养2周后,检测体质量、脏器指数、肠道组织苏木精-伊红染色、细胞增殖标志基因和紧密连接蛋白的mRNA水平及免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)水平;将新生小鼠分为对照组、阪崎克罗诺杆菌组(CS组)、SW-02干预组(CS+SW-02组),饲养至第10天,检测体质量、肠道组织苏木精-伊红染色、细胞增殖标志基因和紧密连接蛋白的mRNA水平及炎症因子水平,研究SW-02对阪崎克罗诺杆菌致坏死性小肠结肠炎的影响。结果显示,鼠李糖乳酪杆菌SW-02能够促进乳鼠早期的生长,促进机体肠道发育和免疫功能,还可以有效改善阪崎克罗诺杆菌对乳鼠肠道造成的损伤,降低炎症。

GABA旁路在阪崎克罗诺杆菌耐干燥胁迫中的作用

阪崎克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中常见的食源性致病菌,γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)是一种广泛存在于各种生物体内的非蛋白氨基酸,而gabT控制的氨基丁酸转氨酶是GABA代谢旁路的关键酶。该研究通过构建阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544 gabT基因敲除菌株(ΔgabT),探讨gabT控制的GABA(γ-氨基丁酸)代谢旁路对阪崎克罗诺杆菌抵抗干燥的作用。结果表明,ΔgabT在干燥胁迫下处理一周后存活率可达到28.64%显著高于野生型菌株(WT)的存活率1.57%。此外,GABA在ΔgabT中累积量高于WT,与存活率结果呈正相关,表明GABA累积能帮助阪崎克罗诺杆菌抵御干燥胁迫。扫描电子显微镜检测结果也显示ΔgabT菌株具有较完整的细胞形态,进一步验证了GABA积累有助于阪崎克罗诺杆菌在干燥环境胁迫下的生存。该研究为阪崎克罗诺杆菌中基于GABA旁路的靶向调控奠定了基础,为阪崎克罗诺杆菌防控提供新思路。

氨苄西林胁迫下阪崎克罗诺杆菌维持连续休眠态的转录组学分析

阪崎克罗诺杆菌是奶粉中常见的食源致病菌,在压力胁迫下会进入连续休眠态。该研究通过转录组测序技术分析氨苄西林压力胁迫下形成的连续休眠态菌的基因表达变化差异,共筛选出220个显著上调基因和416个显著下调基因;并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明,与代谢活性、运动能力(鞭毛合成)、细胞分裂相关基因表达整体显著下调;与药物外排泵、细胞形态改变相关的部分基因表达显著上调;GO富集分析结果还提示严谨反应、毒素抗毒素系统(TAS)相关基因表达显著上调,TAS可能通过调控下游mRNA和NAD+促进连续休眠态的形成。因此,在氨苄西林胁迫下严谨反应可能通过级联调节激活TAS表达,从而促进连续休眠态形成。在该状态下,阪崎克罗诺杆菌通过降低代谢活性、减弱运动能力、抑制细胞分裂,同时改变细胞形态,并增强药物外排能力,从而维持连续休眠态。研究结果为防控压力胁迫下产生的连续休眠态阪崎克罗诺杆菌奠定了理论基础。

免疫磁珠结合显色平板快速检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌

该研究利用羧基化磁珠偶联兔多克隆抗体,制备特异性免疫磁珠,并优化制备条件,然后与显色培养基联用,建立免疫磁珠-显色平板检测方法,用于富集分离婴儿奶粉中的阪崎克罗诺杆菌。结果表明,磁珠与抗体的最佳偶联温度37℃、偶联时间2.0 h,1 mg磁珠的最佳抗体添加量为200μg,饱和偶联量为182.77μg。制得的免疫磁珠,捕获目标菌的浓度范围为10~2~10~7 CFU/mL,捕获率为68.4%~82.4%,与非目标菌反应率低于10%。检测方法应用于模拟污染样品,在目标菌浓度10~2~10~5 CFU/mL时,捕获率为66.2%~71.5%。相比传统方法,该方法的检测周期缩短了2~3 d。

阪崎克罗诺杆菌鉴定分型方法的比较及耐药特征分析

目的开展乳粉原料中分离的阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,C.sakazakii)鉴定分型比较研究及抗生素耐药基因特征分析。方法采用形态学观察、生理生化特征分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、16S rDNA测序分析,和基于全基因组测序技术的平均核苷酸一致性分析、多位点序列分型和基于全基因组的多位点序列分型技术,建立了对分离的2株C.sakazakii的鉴定分型方法,并对不同的方法进行比较,同时预测O-血清型和抗生素抗性基因。结果本研究中分离菌株16-26、31-3经形态学、生理生化反应、16S rDNA、质谱和平均核苷酸一致性分析,均鉴定为C.sakazakii,可信度均在95%以上;MLST预测16-26为ST新型、31-3为ST4型,O血清型均为gnd 3型、galF 2型,均含有9种抗性基因,2株C.sakazakii分离株的抗性基因呈现出多样性。结论通过对分离的C.sakazakii进行鉴定分型比较研究,建立了一种基于表型和分子分型的食源性致病菌鉴定分型方法,为食源性致病菌的有效防控提供了有力的技术支撑和监管依据。

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌

为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应条件,最终建立了一种添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法,可以指示PCR过程中因存在DNA聚合酶抑制剂而导致的假阴性结果。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的特异性。灵敏度实验结果表明,该检测方法对阪崎克罗诺菌纯DNA模板的检测灵敏度为2.15×102fg/μL,对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为9.4×103CFU/m L。对人工污染婴幼儿奶粉的检测结果显示,阪崎克罗诺杆菌接种量为0.94 CFU/g的婴幼儿奶粉样品经过8 h增菌培养后,即可检出。食品样品检测结果表明,不添加扩增内标的PCR检测方法中出现的假阴性结果可被本方法检出。该检测方法特异性强、灵敏度较高,能消除阪崎克罗诺杆菌常规PCR检测方法中可能出现的假阴性结果,适用于婴幼儿配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。

陕西市售婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌流行状况及相关特性研究

对陕西省62个品牌的366份市售婴幼儿配方乳粉和米粉及其他食品中阪崎克罗诺杆菌的污染状况进行调查,并对分离株的相关特性进行分析,旨在阐明陕西市售婴幼儿食品的食用安全性。结果表明,87份样品检出阪崎克罗诺杆菌阳性,平均检出率为23.8%。乳粉阳性样品检出率为18.3%,米粉为27.3%,其他婴幼儿配方食品检出率20.0%。共检出169株阪崎克罗诺菌,其中168(99.4%)株对利福平产生抗性,对其他抗生素耐药的菌株比例依次为阿莫西林20.12%、链霉素18.93%、四环素17.16%、氨苄西林12.43%、庆大霉素11.24%和头孢曲松0.59%等。135株(79.88%)分离株携带ompX基因,120株(71.01%)携带cpa基因、111株(65.68%)携带sip基因、93株(55.03%)携带hly基因。按照95%的相似性,169株分离株脉冲场凝胶电泳(Pulse field gel electrophoresis,PFGE)分型后可被分为4个大簇、8个小簇和1个单基因型,部分源于不同品牌或批次食品的菌株基因型相似性较高,表明陕西省市售婴幼儿配方粉及婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌染问题不容忽视,存在严重的食品安全危胁。

一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法

对磁珠吸附过程中三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA,TE)缓冲液的p H值、蛋白酶K添加量、吸附时间和吸附温度等参数进行了优化。在优化条件下氨基磁珠可以非特异性地直接吸附婴幼儿配方奶粉中存在的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),并结合聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术特异性扩增阪崎克罗诺杆菌DNA,检测灵敏度达到102CFU/mL。此外,经特异性试验验证,此方法用于检测常见食源性致病菌及克罗诺菌属中的非阪崎克罗诺杆菌均无交叉反应。同时,经干扰性试验验证,体系中存在的其他干扰菌株DNA并不会影响阪崎克罗诺杆菌的检测。该方法避免了抗体的使用,解决了抗体制备难度大、成本高等问题,同时克服了传统方法 3～5 d前增菌时间过长的弊端,实现了对婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。

盐酸小檗碱对体外阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用

阪崎克罗诺杆菌是食源性条件致病菌,它能够在食品生产环境以及设备表面形成生物膜,从而成为食品的潜在污染源。本研究探讨了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用,旨在从中药来源中寻找可以控制阪崎克罗诺杆菌生物膜的抗菌物质。采用XTT法评价了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌粘附能力及其生物膜形成的影响。盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌的抑制效果表现出了剂量依赖性,MIC_(90)值为512μg/m L。浓度为1 024μg/m L的盐酸小檗碱能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附能力从而显著抑制生物膜的形成,并且可以部分清除阪崎克罗诺杆菌成熟的生物膜。因此,盐酸小檗碱对于预防控制阪崎克罗诺杆菌生物膜的形成以及由生物膜导致的临床感染具有潜在的应用价值。

PFGE与16S rDNA对阪崎克罗诺杆菌分型的研究

研究脉冲场凝胶电泳(PFGE)与16S rDNA序列分析在阪崎克罗诺杆菌分型中的应用。对分离自不同来源的10株阪崎克罗诺杆菌进行16S rDNA序列扩增及测序,并构建系统发育树进行聚类分析。再利用限制性内切酶Xba I对这10株菌酶切后,进行PFGE电泳分型。16S rDNA序列分析显示,所有分离菌株与ATCC标准菌株在同一系统发育分支下,其序列相似性达到98.37%,并且不能进一步分型。而PFGE分型结果显示,10株分离菌株和2株标准菌株共分成11种PFGE基因型,说明PFGE的分型能力明显优于16S rDNA序列分析,部分菌株的基因型与分离来源具有一定的相关性,所以PFGE分型方法可用于阪崎克罗诺杆菌分子分型及溯源的研究。

基于rpoB基因的阪崎克罗诺杆菌分子检测体系的建立及其应用

通过生物信息学的方法,利用阪崎克罗诺杆菌及其邻近细菌的rpoB基因序列设计了一对特异性引物ESrpoBF及ESrpoBR。特异性检测表明,该对引物能对阪崎克罗诺杆菌进行有效的扩增,PCR扩增产物为154bp大小的条带,而对其余近缘肠杆菌均无阳性扩增。灵敏度检测显示,该对引物在常规PCR及实时定量PCR的检测极限分别为10 pg/μL和10 fg/μL。进一步利用该对引物对浙江省14个重要饮用水源地进行分子检测。结果表明,在6个饮用水源检测到阪崎克罗诺杆菌,检出率为43%。

乳粉中阪崎克罗诺杆菌快速检测方法应用比较

对几种应用较为广泛的阪崎克罗诺杆菌分子生物学检测技术进行比较分析,探求适用于食品实验室检验要求的快速准确的阪崎克罗诺杆菌检测方法。通过DNA灵敏度检测及样品添菌实验比较交叉引物等温扩增法、实时荧光PCR法、环介导等温扩增法的检测灵敏度;通过实际样品检测,以常规培养生化鉴定为基准方法,进行灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确度等5方面比较分析。DNA灵敏度检测显示实时荧光PCR法最灵敏,检测低限在0.9 fg/test;样品添菌实验,3种方法检测低限均可达100 cfu/100 g;与基准方法比较,3种方法灵敏度均达到100%,假阴性率0%,特异性在98.8%～99.0%之间,假阳性率1.0%～1.2%之间,相对准确度98.8%～99.0%之间,均能满足食品实验室检测要求。3种分子生物学方法检测时间短,同基准方法比较,检测结果大致相符,无漏检情况,有假阳性结果,可用于日常阪崎克罗诺杆菌初筛检测。

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的:建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法:根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果:解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0μg。结论:解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。

阪崎克罗诺杆菌分离菌株的核糖体分型研究

利用Riboprinter对分离到的15株阪崎克罗诺杆菌进行了鉴定及核糖体分型,并利用Bio Numeicrus软件对其结果进行分析,如果按照相似性大于80%计算,根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到0.808。结果表明,核糖体分型(ribotyping)是一种适用于阪崎克罗诺杆菌的快速分子分型方法,可将不通来源的阪崎克罗诺杆菌分离菌株区别开来,能够对由该菌引起的食品中毒事件能够进行快速的溯源。

婴幼儿乳粉和米粉中阪崎克罗诺杆菌的耐受性研究

以婴幼儿乳粉和米粉中分离到的15株不同基因型的阪崎克罗诺杆菌为材料,研究其对不同温度、酸碱度和微波的耐受性以及对枯草杆菌二联活菌颗粒(商品名:妈咪爱)和产乳酸菌素乳酸菌的敏感程度。采用平板计数法检测阪崎克罗诺杆菌在不同处理后的存活率,衡量菌株的耐受性;采用皿内抑菌法检测妈咪爱和产乳酸菌素乳酸菌对阪崎杆菌的抑制作用。结果表明:70℃处理20min后,15株阪崎克罗诺杆菌的存活率均低于0.11%,对阪崎克罗诺杆菌的致死作用明显高于50℃和60℃(P<0.01)。阪崎克罗诺杆菌经pH4.0、pH6.0和pH8.0条件处理20min后,部分菌株被致死,pH4.0时的存活率明显低于其它2组(P<0.01)。微波处理2min后,大部分供试菌株的死亡率超过99%,菌株间存活率无显著性差异(P>0.05)。产乳酸菌素乳酸菌和妈咪爱对供试菌株均有一定的抑制作用,部分菌株对其的敏感程度具有极显著差异(P<0.01)。结论:阪崎克罗诺杆菌的耐受性和敏感程度存在差异,采用适当的条件处理能有效防止阪崎克罗诺杆菌对婴幼儿食品的污染。

阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种重要的食源性条件致病菌,易引发新生儿、早产儿、低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、通过生化鉴定的37株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象,利用16S rDNA基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和分型。结果表明:ES4并非为阪崎克罗诺杆菌,说明采用16S rDNA基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠;通过构建系统发育树分析,分离菌株位于同一系统发育分支;根据序列同源性比对,可将这一分支下的所有菌株分成7个子群,这表明16S rDNA基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型,进一步揭示其系统发育关系。

阪崎克罗诺杆菌耐热性和耐酸碱性的研究

研究阪崎克罗诺杆菌分离菌株对温度及酸碱的耐受性,从而对婴儿配方粉生产过程中的阪崎克罗诺杆菌的污染进行控制。对4株来源不同的阪崎克罗诺杆菌进行不同温度和酸碱条件的处理,并将处理后的菌液涂布于TSA培养基观察菌株的存活情况;以阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544为阳性对照。结果显示,不同来源的菌株对温度及酸碱的耐受性存在一定的差异,这为降低该菌的感染风险提供了依据。

硅胶表面阪崎克罗诺杆菌生物膜的形态观察

阪崎克罗诺杆菌是一种食源性条件致病菌,它能导致婴幼儿罹患坏死性小肠结肠炎、菌血症、脑膜炎等疾病。在硅胶表面形成生物膜,可能是导致阪崎克罗诺杆菌感染的重要途径。使用结晶紫法测定阪崎克罗诺杆菌ATCC BAA-894在食品级硅胶表面的静态生物膜成熟曲线,并且采用扫描电子显微镜对其在食品级硅胶表面的静态生物膜的形成过程进行形态学观察。观察到阪崎克罗诺杆菌在硅胶表面形成了具有三维结构的成熟生物膜形态。在3 h能粘附到硅胶表面,并且在12 h^24 h已经形成了比较成熟的生物膜。

乳中阪崎克罗诺杆菌的快速捕获方法的建立

利用免疫磁捕获技术,建立了高效、快速的乳中阪崎克罗诺杆菌的捕获方法。将阪崎克罗诺杆菌抗体与Fe_3O_4磁珠偶联,制备特异性免疫磁珠并快速富集乳中的阪崎克罗诺杆菌。结果表明:此方法特异性强,且针对纯培养物中阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度达到104~10~5m L^(-1),乳中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度达到10_5~10~6m L^(-1)。该方法能够大大缩短阪崎克罗诺杆菌的增菌时间,辅以适宜的检测方法即可实现对乳中阪崎克罗诺杆菌的快速富集,并且具有更高的特异性。