防御假单胞菌H78中crp基因对抗生素合成的调控作用

crp基因(编码cAMP受体蛋白)作为全局调控因子广泛存在于各种细菌中,在不同菌株中表现不同的调控功能。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)H78能产生硝吡咯菌素(Prn)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)和藤黄绿菌素(Plt)等多种广谱抗生素。为探究P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成的调控作用,利用基因无痕敲除、HPLC分析、lacZ报告基因分析等技术,分析crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成及基因表达的影响。结果表明:H78菌株中crp基因的敲除导致Prn合成操纵子prnABCD表达显著下降;Plt合成及操纵子表达显著上升;2,4-DAPG合成及操纵子表达小幅下降。因此,P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn合成存在显著的正调控作用,而对Plt合成存在明显的负调控作用,对2,4-DAPG合成存在一定的正调控作用。

防御假单胞菌FD6中RpoS蛋白理化性质预测及rpoS-lacZ转录融合结构构建

Sigma因子是一类依赖于DNA的RNA聚合酶亚基,在生防细菌中通常可调控抗生素的合成。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) FD6中rpoS基因编码的RpoS蛋白是一类非必需sigma因子。利用BPROM在线工具预测rpoS基因的启动子区,并用PCR技术将其克隆到pRG970Km质粒中无启动子的lacZ基因上游,将构建的rpoS-lacZ转录融合质粒转化至菌株FD6中,为后续抗生素合成调控机制的探究提供重要的试验材料。此外,利用生物信息学方法分析P.protegens FD6中RpoS的功能,并通过邻接法构建RpoS的系统发育树。结果表明:FD6中RpoS蛋白分子量约为38 ku,理论等电点为5.14;具有多个磷酸化位点;无跨膜结构,且N端无信号肽;二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。系统发育树结果显示, FD6中RpoS蛋白的氨基酸序列与防御假单胞菌Pf-5相似性最高,二者在系统发育树中位于同一分支。

防御假单胞ZF509的分离鉴定及其对甜瓜细菌性果斑病的防治效果研究

为了筛选对瓜类果斑病(acterial fruit blotch,BFB)具有良好拮抗效果的生防细菌,本研究从黑龙江马铃薯根际土壤中分离得到一株对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli具有显著抑制效果的生防菌株ZF509。经形态学观察、生理生化特征、Biolog测定和多基因系统发育树分析,鉴定菌株ZF509为防御假单胞Pseudomonas protegens。经抑菌谱分析,菌株ZF509对4种病原细菌、8种病原真菌具有显著拮抗作用。经酶活检测和抑菌物质分析,ZF509具有溶磷能力,可分泌蛋白酶,合成生物膜,产生氢氰酸,具备2-羟基、2,4-DAPG、藤黄绿脓菌素以及吡咯菌素4种抑菌物质的合成编码基因。盆栽试验结果表明,接种ZF509的处理果斑病发病的病情指数显著降低,防效可达73.46%,显著优于对照药剂噻霉酮处理。综上所述,菌株ZF509对瓜类细菌性果斑病具有良好的生防潜力和应用前景。

CbrB在防御假单胞菌Pf-5生物防治中的作用

【目的】从基因水平探究碳分解代谢阻遏调控系统中CbrB对防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)Pf-5生物防治能力的影响。【方法】通过基于pJQ200SK的二次同源重组法构建cbrB编码区无痕缺失突变菌株Pf5274,采用基于pBBR1Am的质粒回补法构建cbrB互补菌株及其对照菌株,通过测定菌株OD600、结晶紫染色法、琼脂平板法、平板对峙法和pltL'-'lacZ融合报告菌株,分析CbrB对防御假单胞菌Pf-5生长、生物膜形成、运动性、抗真菌活性和藤黄绿脓菌素合成的影响。【结果】CbrB在天然培养基LB中显著抑制Pf-5的生长,而在基础培养基M9-葡萄糖中则显著促进Pf-5的生长;CbrB显著促进Pf-5的运动性,但是却抑制其生物膜形成、抗真菌活性及藤黄绿脓菌素合成。【结论】CbrB在调控防御假单胞菌Pf-5生物防治方面具有一定的作用,具体表现在菌株生长、生物膜形成、运动性、抗真菌活性及藤黄绿脓菌素合成等方面。本研究为利用基因工程技术提高生防菌株生物防治能力提供理论依据,并为深度发掘藤黄绿脓菌素生物合成奠定基础。

防御假单胞菌H78中sRNA基因crcY/Z正调控藤黄绿菌素合成

防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)H78能产生藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)等多种广谱抗生素,这些抗生素的合成存在复杂的调控机制与网络。本研究旨在研究H78菌株碳分解代谢阻遏调控系统(Cbr/Crc)中两个同源小RNA(small RNA,sRNA)基因crcY和crcZ对Plt合成的调控机制。首先,利用无痕敲除方法构建crcY/Z双基因敲除突变体,发酵分析结果显示crcY/Z双敲除使H78菌株几乎完全丧失Plt的合成;其次,基因互补实验证实crcY或crcZ基因的外源互补能恢复crcY/Z双敲除突变体的Plt合成;最后,利用lacZ报告基因分析技术进一步证实crcY/Z双突变使Plt合成操纵子pltLABCDEFG的表达显著降低。结果表明:防御假单胞菌sRNA基因crcY/Z对Plt合成及基因表达存在显著的正调控作用。本研究将为进一步阐明Plt合成的调控网络及通过代谢工程提高Plt产量奠定基础。

防御假单胞菌双突变体H78ΔrsmA/E中hmgA基因对藤黄绿菌素生物合成的抑制

【背景】防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) H78是分离于油菜根际的一株生防菌,其能合成藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)等多种广谱抗生素,H78的rsmA/E双突变体中Plt合成被完全抑制。【目的】通过转座子诱变技术,筛选H78ΔrsmA/E双突变体中重新激活Plt合成的下游调控因子。【方法】通过同源重组的方法在pltL基因下游插入红色荧光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)基因来指示Plt操纵子表达的激活情况;利用转座子随机插入突变、半随机PCR技术筛选并定位目标基因;通过基因回补等方法进一步验证基因功能。【结果】从约2万株H78ΔrsmA/E的转座子突变体中筛选到一株高产Plt和某种黑色素的菌株,并确定其插入位点为hmgA基因,hmgA基因回补能重新抑制H78ΔrsmA/E的Plt合成。【结论】假单胞菌双突变体H78ΔrsmA/E中hmgA基因对Plt的合成存在强烈抑制作用,是潜在的RsmA/E下游调控基因。本研究为进一步阐明Plt合成的调控机制与网络及通过基因工程提高Plt产量奠定了基础。

生防假单胞菌FD6电击转化条件的优化

不同细菌电击转化效率各异,为筛选防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) FD6电击转化最佳条件,选取具卡那霉素抗性标记的质粒pBBR-rpoD,从电场强度、电击时间、质粒添加量、电击悬浮溶液和细菌生长阶段5个方面优化电击转化条件。结果表明:当细菌培养至D600 nm值1.4左右时,在电场强度为12 kV·cm^(-1)、电击时间为4 ms、质粒添加量为200 ng,并以1 mmol·L^(-1) HEPES作为电击悬浮溶液时转化效率最高,可达1.1×10^(5)转化子·μg^(-1)(DNA)。此外,HEPES浓度的改变并未对转化效率产生影响。这一研究建立了一套防御假单胞菌FD6的高效电击转化体系,为今后该菌株在分子水平上的遗传操作提供了重要参考。

生防菌株PF-1基于全基因组数据的分类鉴定及拮抗能力分析

基于全基因组数据,确定生防菌株PF-1的分类地位,验证其对植物病原菌的拮抗作用以及挖掘其潜在的生防功能。通过全基因组中16S rRNA基因序列的系统发育分析及基因组分析方法确定生防菌株PF-1的分类地位,通过平板对峙方法研究其对马铃薯枯萎病菌和棉花黄萎病菌的拮抗能力;利用antiSMASH软件分析和预测菌株PF-1的抗生素相关基因并挖掘其生防潜力。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析及基因组分析结果,PF-1被鉴定为防御假单胞菌(Pseudomonas protegens),同时发现PF-1基因组中存在15种次生代谢产物基因簇,具有良好的抑制病原菌生长和提高植物抗病性的能力,在农业中具有良好的应用前景。