人α防御素-5多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用的研究

目的探讨人α防御素-5（humanα-defensin-5,HD-5）多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒（herpes simplex virustype2,HSV-2）的作用及其机制。方法以绿猴肾细胞（Vero）为宿主细胞,采用CCK-8法首先分析10-200μg/ml浓度范围内HD-5多肽的细胞毒性,再以HSV-2感染Vero细胞,分别于感染前后和感染的同时加入100μg/ml的HD-5多肽,72h后测定细胞保护率,结合细胞病变效应观察,分析HD-5抗HSV-2的作用效果和起效环节,并通过改变培养基中血清的浓度,观察血清对HD-5抗病毒作用的影响。结果在100μg/ml浓度以内,HD-5多肽几乎无细胞毒性,提前或同时加入HD-5多肽可以显著抑制HSV-2病毒引起的细胞病变反应、提高细胞保护率（P〈0.01）,而在HSV-2感染2h后加入HD-5多肽对Vero细胞的保护作用不明显（P〉0.05）;血清浓度会显著影响HD-5多肽的抗HSV-2活性,血清浓度越高,HD-5多肽对细胞的保护率越低。结论HD-5多肽在体外具有显著的抗HSV-2感染活性,其作用机制主要是通过干扰病毒对细胞的粘附、侵入而发挥作用。

重组β-防御素2多肽对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响

目的:观察重组β-防御素2多肽预处理对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响。方法:SPF级SD大鼠48只随机分成对照组和防御素组,采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型,防御素组在CLP前48h经气管插管气道滴注107PFU重组腺病毒(含有β-防御素2编码基因),而对照组则同法给予对照腺病毒(不含β-防御素2编码基因)。分别于CLP后0、12、36和72 h处死大鼠,取肺组织,采用透射电镜,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,采用电镜、苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化。结果:TUNEL检测显示,对照组大鼠CLP后12、36和72 h肺组织细胞凋亡指数显著增加(P<0.01);与对照组相比,防御素组CLP后相应时间点肺组织细胞凋亡指数显著降低(P<0.05)。HE染色可见,两组大鼠CLP后12、36和72 h肺泡及肺泡间质充血、水肿,炎症细胞渗出,肺泡腔不同程度狭窄。与对照组相比较,防御素组相应时间点肺组织内炎症细胞渗出减少,间质水肿减轻。结论:重组β-防御素2多肽预处理能抑制脓毒症肺组织的细胞凋亡,对急性肺损伤(AL I)具有保护作用。

β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达

目的:探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2的可行性。方法:采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2(rBD 2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,重组质粒pShuttle-CMV-rBD 2转化E.coli B J5183-AD-1后,与腺病毒基因组质粒pA dE asy-1发生同源重组,重组质粒pA dE asy-rBD 2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒感染cos-7细胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,进行β-防御素2多肽的体外和体内表达,采用W estern b lot与免疫组化方法检测其表达。结果:重组腺病毒表达载体构建成功,包含大鼠β-防御素2基因,滴度达到109PFU/m l,W estern b lot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达。结论:重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2。

外阴阴道假丝酵母菌病与抗菌肽LL-37及防御素5的关系

目的:探讨外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)及复发性VVC(RVVC)患者阴道分泌物中抗菌肽LL-37和防御素5(HD-5)的表达及意义。方法:收集VVC患者31例、RVVC患者27例及对照组30例,应用科玛嘉念珠菌显色培养基筛选出白假丝酵母菌感染患者,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定其阴道分泌物中抗菌肽LL-37及HD-5的含量。结果:VVC组LL-37、HD-5水平较对照组均升高,RVVC组LL-37水平较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);RVVC组HD-5水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05);VVC组LL-37、HD-5水平与RVVC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:抗菌肽LL-37与VVC发病及RVVC反复发作有关;HD-5与VVC发病有关,但与RVVC复发的关系尚不确切。

重组β-防御素2在脓毒症所致大鼠急性肺损伤发生发展中的作用

目的:探讨重组β-防御素2(BD 2)对脓毒症所致大鼠急性肺损伤的保护作用以及对预后的改善。方法:SD大鼠36只随机分为对照组及实验组,每组各18只,分别予以气管滴注对照腺病毒载体(A d-V,107PFU/m l)及可表达大鼠β-防御素2(rBD 2)的腺病毒载体(A d-rBD 2,107PFU/m l)各100μl。48 h后行盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型;复制此模型后36h处死大鼠(n=12,实验组、对照组各6只),行腹腔灌洗液细菌计数、肺组织常规病理切片观察以及大鼠生存率分析(n=24,A d-V组、A d-rBD 2组各12只)。结果:与对照组(A d-V组)比较,实验组(A d-rBD 2组)肺组织损伤程度减轻,生存率明显提高(P<0.05),腹腔灌洗液细菌计数无明显差别。结论:在体内表达的重组β-防御素2可明显改善脓毒症所致的急性肺损伤的肺部病变及其预后。

人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

目的构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。

β-防御素2研究进展

防御素是一类分子量约为4．0～5．0kMr、含有6个半胱氨酸残基、三对二硫键的阳离子多肽。防御素不仅通过直接杀菌作用抵御入侵机体的病原微生物，还在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中起着重要作用。β-防御素2是人体中第一个被发现的可诱导性防御素，因此，β-防御素2的基因表达调控、生物学活性、与皮肤／肺部疾病发生发展相关性等方面的研究较为深入。采用重组DNA技术从原核表达体系、真核表达体系中获取具有生物学活性的β-防御素2多肽，并研究其在呼吸道细菌感染、脓毒症所致肺损伤／肺功能障碍发生发展中的保护作用，将有助于阐明β-防御素2在免疫相关疾病中的作用，有助于阐述肺损伤／呼吸功能障碍发生发展的机制与防治。

白细胞介素-10对人外周血白细胞β-防御素2基因诱导性表达的影响

目的:探讨炎症抑制因子白细胞介素-10(白介素-10)在β-防御素2(hBD-2)基因诱导性表达中的作用。方法:22例健康人被纳入本研究中,以终浓度0 ng/m l的LPS、100 ng/m l的LPS、10ng/m l的IL-10、100 ng/m l的LPS+10 ng/m l的IL-10加入900μl人外周血中,于37℃刺激培养6 h后,提取外周血白细胞总RNA,用实时定量RT-PCR的方法测定外周血白细胞hBD-2mRNA的表达水平。结果:0 ng/m l的LPS或10 ng/m l的IL-10刺激6 h的白细胞中未检测到hBD-2 mRNA,100 ng/m l的LPS刺激6 h后hBD-2mRNA的表达水平为166.9±35.14,而IL-10与LPS共同刺激6 h后hBD-2 mRNA的表达水平为30.40±9.18。IL-10使hBD-2mRNA的诱导性表达水平明显降低(P<0.05)。结论:人外周血白细胞中hBD-2基因呈现诱导性表达,IL-10能下调hBD-2的诱导性表达。

溃疡性结肠炎中防御素、一氧化氮和丙二醛的表达

背景:溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,其病因尚不明确。近年来,防御素家族在先天免疫中的作用受到广泛关注。目的:研究UC患者结肠组织中中性粒细胞防御素人中性粒细胞肽(HNP)1-3与一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)的相关性,了解三者在UC发病中的作用。方法:以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测16例活动期UC患者结肠组织和10例正常结肠组织中HNP1-3mRNA的表达,分别以硝酸还原酶法和硫代巴比妥酸(TBA)显色法检测结肠组织NO和MDA水平。结果:UC患者结肠组织HNP1-3mRNA和NO、MDA的表达水平显著高于正常对照组(P<0.01),其中UC受累黏膜又显著高于未受累黏膜(P<0.01)。UC受累黏膜中HNP1-3mRNA与NO、MDA的表达具有显著相关性(rs1=0.643,P<0.01;rs1=0.831,P<0.01)。结论:HNP1-3可能参与了UC结肠组织的炎症损伤过程,NO和MDA可能与HNP1-3协同发挥作用。

致倦库蚊防御素基因的克隆与生物信息学分析

目的:获取致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin全长编码序列。方法:采用RT-PCR方法扩增致倦库蚊(贵阳株)CxDefensin开放阅读框(ORF)序列,并通过生物信息学方法分析其核苷酸和蛋白质序列。结果:CxDefensin ORF序列全长300 bp,编码99个氨基酸,包含1个内含子,蛋白质分子量是10.58 kDa,等电点为6.52。CxDefensin蛋白与其他昆虫的defensin蛋白具有同源性。结论:所获致倦库蚊(贵阳株)防御素基因Cx-Defensin归属昆虫防御素基因家族,为昆虫β型防御素。

家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析

目的:克隆家蝇幼虫防御素(defensin)基因并进行序列分析。方法:根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物,以家蝇幼虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增、测序,并利用软件进行序列分析。结果:克隆得到的defensin基因的长度为330bp,编码92个氨基酸,4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同,为K或N。结论:从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因,发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白,并初步预测了两种前体蛋白的化学性质和二级结构,为该基因的重组表达奠定了基础。

防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制。方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFP中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP。(2)经组织块法原代培养人阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况。结果:成功构建了pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24 h时表达量最高。联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6 h时分泌最低,24 h达高峰,然后呈下降趋势。HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势。结论:HD5和LL37成功转染入人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础。

改良兔防御素1对周围神经损伤修复后神经再生的作用

背景:周围神经损伤是临床常见的一类疾病,严重影响患者的生活质量。如何促进周围神经损伤后神经的再生修复是临床重要的课题。目的:探讨改良兔防御素1对周围神经损伤修复后神经再生的作用及功能恢复的影响。方法:18只SD大鼠随机分为3组:神经生长因子神经营养因子组、改良兔防御素1组以及生理盐水对照组。将所有大鼠坐骨神经离断后使用可降解甲壳质生物套管套接修复神经断端,术后连续7 d以神经营养因子、改良兔防御素1以及生理盐水注射到臀肌中。结果与结论:术后6周,神经营养因子组和改良兔防御素1组大鼠的坐骨神经指数较生理盐水组高,但3组大鼠的运动神经传导速度:神经营养因子组>兔防御素1组>生理盐水组,且改良兔防御素1组大鼠的再生神经纤维直径、轴突直径和髓鞘厚度较神经营养因子组大鼠小,但相对于生理盐水组大。提示改良兔防御素1对于周围神经损伤后神经再生具有促进作用。改良兔防御素1促进神经再生的作用机制可能与巨噬细胞清理髓鞘残留、改善神经再生环境有关。

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD 2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法:PCR扩增不含前导序列的HBD 2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD 2-cDNA),利用B g lⅡ和B amHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD 2-cDNA的克隆载体,利用N colⅠ和H indⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET 32-nsmHBD 2-cDNA,在大肠杆菌中BL 21(DE 3)中诱导表达含HBD 2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD 2多肽。采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD 2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD 2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD 2-cDNA几乎不含可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分。重组HBD 2对E.coli K 12 D 31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/m l时,90%细胞的生长被抑制。结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD 2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD 2多肽的原核高效表达。

外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道人类防御素分泌及发病相关因素的研究

目的通过对外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）患者与健康妇女的比较，对VVC发病的相关因素进行分析，并研究VVC患者的阴道局部免疫状态。方法应用病例对照研究方法，对VVC患者（VVC组，60例）及无VVC妇女（正常对照组，60例）进行比较，研究对象均填写调查表，取阴道分泌物进行阴道分泌物常规检查、pH值检测及细菌培养，用酶联免疫吸附试验对阴道冲洗液进行相关细胞因子[白细胞介素2、白细胞介素4、人类防御素5、人类β防御素（HBD）1、HBD2等]含量的检测分析。结果（1）两组妇女的学历、对妇科感染的了解程度、妇科炎症病史、卫生习惯、性生活情况、药物应用情况比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；正常对照组慢性宫颈炎的发生率（43％，26／60）高于VVC组（22％，13／60），两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）正常对照组与VVC组妇女阴道pH值比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。（3）VVC组妇女阴道分泌物检出假丝酵母菌43例，检出率为72％（43／60）。（4）VVC组妇女阴道冲洗液中，人类防御素5、HBDl、HBD2含量[分别为（0．94±0．44）mg／L、（3．1±0．4）μg／L、（10±6）μg／L]明显高于正常对照组[分别为（0．61±0．27）mg／L、（2．7±0．4）μg／L、（7±3）μg／L]，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论VVC是女性常见的外阴阴道炎症，在育龄期妇女VVC的发生与学历、对妇科感染的了解程度、妇科炎症病史、卫生习惯、性生活情况、药物应用情况无明显相关性。人类防御素的作用可能与VVC的发病密切相关。

茶树类防御素CsDEF2基因的克隆与序列及表达分析

防御素(Defensin)是一类广泛存在动植物中的阳离子短肽,具有多种防御功能。本研究利用转录组数据库,从茶树叶片中克隆了一个类防御素基因CsDEF2并对该基因进行了生物信息学分析,CsDEF2的开放阅读框(ORF)全长246 bp,编码81个氨基酸,蛋白分子量8.68 kD,等电点9.12.序列比对和系统发育分析表明,CsDEF2是防御素家族中的新成员。此外,本研究对病原真菌(茶树镰刀菌)侵染后的茶树叶片中该基因的表达水平进行半定量分析。结果表明,茶树镰刀菌侵染的叶片CsDEF2基因的表达量相较未侵染叶片明显上调,说明CsDEF2基因可能在防御真菌侵染发挥作用。以上研究结果为提高茶树及其它作物的生物抗性提供了新的靶基因,同时也为探讨茶树生物抗性奠定了基础,具有重要的理论与应用价值。

脂多糖诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及核转录因子κB活性的变化

目的:观察脂多糖(LPS)诱导人气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达及核转录因子κB(NF-κB)活性的变化,探讨NF-κB在LPS诱导人气道上皮细胞hBD-2表达中的作用。方法:体外培养人气道原代上皮细胞,用不同剂量LPS刺激,RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达,凝胶迁移试验(EMSA)检测不同时相NF-κB活性的变化。结果:LPS刺激2h后可见人气道上皮细胞hBD-2mRNA表达,并呈时间、剂量依赖性;NF-κB在LPS刺激1h后明显活化,并与LPS剂量正相关,抗体超迁移率实验结果显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了NF-κB的活化。结论:一定剂量的LPS可诱导人气道上皮细胞hBD-2mRNA表达,NF-κB在LPS诱导气道上皮细胞hBD-2mRNA起重要的调控作用。

重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠急性肺损伤的保护作用

目的 观察重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用。 方法10只清洁级雄性成年SD大鼠,随机分为防御素组和对照组,每组5只。防御素组大鼠暴露声 门后,气管内滴注5×107PFU／ml重组腺病毒(含有β-防御素-2编码基因)50μl,对照组给予等量对照腺 病毒(不含β-防御素-2编码基因)。48 h后两组气管内滴注6×108CFU／ml绿脓杆菌ATCC27853 200μl, 制备绿脓杆菌感染致ALI模型。气管内滴注绿脓杆菌24 h后处死大鼠,采集肺泡灌洗液,进行绿脓杆 菌菌落数和白细胞计数;观察肺组织病理学变化,并测定肺组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达水 平。结果与对照组比较,防御素组BALF中绿脓杆菌菌落数、白细胞计数、肺组织ICAM-1表达水平 及肺病理组织学评分降低(P<0．05)。结论重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠ALI有一 定的保护作用,可能与其杀菌作用和下调肺组织ICAM-1的表达有关。

阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用

目的研究人阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5（HD5）真核重组质粒后对假丝酵母菌的抑制作用及其分泌白细胞介素8（IL-8）水平的变化。方法原代培养阴道上皮细胞并传代后，分为无菌组和带菌组，每组内再分别转染LL-37质粒pcDNA3．1（＋）／LL-37-EGFP、HD5质粒pcDNA3．1（＋）／HD5-EGFP及联合转染两种质粒，并设未转染质粒的阴道上皮细胞为对照；带菌组均与假丝酵母菌共培养。于6、12、24、48h分别收集培养上清液，ELISA方法检测LL一37、HD5及IL．8的水平；采用葡萄糖消耗法检测各组细胞对假丝酵母菌的抑菌效果（以吸光度值表示）。结果（1）各时段检测结果显示，转染质粒的各组细胞分泌LL-37、HD5、IL-8的水平在转染24h时达高峰，然后呈下降趋势，其中带菌组中联合转染细胞分泌LL-37、HD5、IL-8的水平均高于其他细胞，峰值分别为（100．16±0．81）ng／ml、（58．50±2．08）μg／ml和（101．03±1．59）pg／ml，差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）各时段抑菌效果比较显示，无菌组内各细胞的吸光度值比较，差异无统计学意义（P〉0．05），吸光度值呈缓慢下降趋势，其中，联合转染细胞6、12、24、48h的吸光度值分别为3．610±0．010、3．590±0．010、3．560±0．010、3．530±0．010（P〉0．05）；带菌组中联合转染细胞吸光度值6、12、24、48h分别为3．210±0．010、3．150±0．030、3．099±0．030、2．970±0．040，明显高于组内其他细胞，差异有统计学意义（P〈0．01），且下降趋势较其他细胞缓慢。结论阴道上皮细胞转染LL-37及HD5质粒后抵抗假丝酵母菌的能力增强，LL-37和HD5可诱导炎症趋化因子IL-8的分泌。