意大利蜜蜂防御素-2蛋白序列分析及表达特性研究

【目的】对意大利蜜蜂(Apis mellifera)防御素-2蛋白(Defensin-2,Def-2)进行蛋白序列分析和表达特性研究,以期为意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御机制、发育和代谢途径研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学在线网站及软件对Def-2蛋白进行预测分析,并采用实时荧光定量PCR对意大利蜜蜂不同发育时期(幼虫期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂)的基因相对表达量进行检测分析。【结果】意大利蜜蜂防御素-2基因(Def-2)编码104个氨基酸残基,相对分子量为11858.90 Da,理论等电点(pI)为8.54,为两性不稳定蛋白。该蛋白N-末端有一段含21个氨基酸的信号肽,存在1个跨膜结构域,亚细胞主要定位于内质网、液泡和高尔基体,无糖基化位点,存在15个磷酸化位点,其二级结构以无规卷曲(54.81%)为主、延伸链(28.85%)分布较多,α-螺旋(16.35%)分布较少,蛋白序列高度保守,与Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd等蛋白存在基因互作关系,具有防御蛋白样结构域(DEFL),结构域采用以半胱氨酸稳定的α/β支架为特征的结构,亲缘关系与小蜜蜂极为相近。Def-2基因在意大利蜜蜂不同发育时期的表达水平存在差异且随日龄增大而升高,30 d的相对表达量显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】意大利蜜蜂Def-2蛋白属于两性不稳定蛋白,参与细胞间信号传输并维持细胞正常形态;蛋白序列高度保守,亲缘关系与小蜜蜂最近,且该基因在30 d成年期工蜂中高丰度表达,推测其可能调节免疫基因转运而影响蜜蜂的免疫识别过程。

创伤后感染致多器官功能障碍综合征患者血清β-hBD-2、OPN、pro-ADM和NPt水平的变化

目的:探讨多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)患者的炎症感染病理过程中炎性介质水平的变化。方法:血清人类β防御素-2(humanβ-defensin-2,β-hBD-2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和新蝶呤(neopterin,NPt)采用酶联免疫分析法(ELISA)测定,肾上腺髓质素前体(pro-adrenomedullin,pro-ADM)检测采用化学免疫发光法。结果:四项血清标志物测定结果分别显示,对照组和确诊时组β-hBD-2、OPN、pro-ADM、NPt四种血清炎症介质标志水平均显著高于正常人组(P<0.05,P<0.01),出院前组β-hBD-2、OPN水平显著高于正常人组,另两项指标均与正常人组比较无显著性差异(P均>0.05);同时确诊时组与对照组比较β-hBD-2、OPN、pro-ADM三项指标水平也显著升高(P<0.05,P<0.01),NPt水平患者组呈略高,但无统计学意义(P>0.05);出院前组β-hBD-2、OPN、pro-ADM、NPt四种血清炎症介质标志水平均显著低于确诊时组(P<0.05,P<0.01)。结论:MODS患者的炎症感染病理过程中炎性介质水平显著升高,其测定对于临床抗感染治疗提供重要价值。

健胃愈疡片治疗胃溃疡临床疗效观察及其对胃黏膜修复作用机理研究

目的:分析健胃愈疡片治疗胃溃疡患者的临床疗效及其对胃黏膜白细胞介素-1β(IL-1β)、核因子-κB、β防御素-2蛋白表达的影响,探讨其对胃黏膜修复的机理。方法:将经胃镜确诊(中医辨证为肝郁脾虚证)的86例胃溃疡患者患者按随机原则分为对照组和治疗组。对照组使用根除Hp三联用药治疗,治疗组加用健胃愈疡片治疗,4周为1个疗程。治疗前、后均记录患者的症状积分、胃镜疗效、及HP清除率;取胃黏膜活检,并检测IL-1β、NF-κB及β防御素-2蛋白表达水平。结果:治疗后治疗组的症状积分明显高于对照组(P<0.05);两组患者胃镜下溃疡总体有效率比较无显著性差异(P>0.05);治疗组HP清除率高于对照组(P<0.05);免疫组化结果显示治疗后两组IL-1βmRNA、NF-κB p65及β防御素-2 mRNA表达明显降低,与治疗前比较差并均有统计学意义(P<0.05),但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:健胃愈疡片可以有效改善胃溃疡患者的临床症状,明显降低胃黏膜IL-1βmRNA、NF-κB p65及β防御素-2 mRNA表达的水平,有助于溃疡黏膜的修复。

健胃愈疡饮片对胃黏膜修复作用的机理研究

目的:观察健胃愈疡饮片对胃溃疡患者的治疗的临床效果,并分析它对胃黏膜白细胞介素表达的影响。方法:把经过胃镜手段确诊的90例胃溃疡患者(中医上辨证为肝郁脾虚)按随机原则进行分组,分为对照组和治疗组。对照组患者使用根除HP的三联用药治疗,治疗组患者加用健胃愈疡饮片进行治疗,1个疗程为4周。治疗的前、后都记录下患者的胃镜疗效、症状积分、H P清除率等;取胃黏膜进行活检,并检测NF-κB、IL-1β及β防御素-2蛋白的表达水平。结果:治疗组在治疗后症状积分显著高于对照组(P<0.05);对两组患者在胃镜下溃疡总体有效率的比较没有显著性差异(P>0.05);治疗组患者HP清除率高于对照组患者(P<0.05);免疫组化的结果显示,治疗后两组患者的NF-κB p65、IL-1βmRNA以及β防御素-2 mRNA表达有明显下降,与治疗前的比较差都具有统计学意义(P<0.05),但两组之间的比较差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:健胃愈疡饮片能够有效缓解胃溃疡患者的临床表现,显著降低胃黏膜NF-κB p65、IL-1βmRNA以及β防御素-2 mRNA的表达水平,对溃疡黏膜修复有益。

人hBD-2-haFGF融合基因原核表达的响应面优化

HBD-2-haFGF是一种具有痤疮治疗作用的新型融合蛋白。为提高重组大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-21b-hBD-2-haFGF中hBD-2-haFGF基因的表达水平,本研究尝试优化其诱导表达条件。分别选取IPTG浓度、诱导温度、培养基pH和诱导时间进行单因素试验,在此基础上设计4因素3水平响应面实验,以蛋白表达量作为考察指标。经过响应面分析,响应面二次回归方程为y=55.33-1.59A+0.754B+0.26C+6.33D-0.56AB+5.42AC+9.66AD-2.12BC-0.93BD-2.84CD-4.73A^2-8.11B^2-1.74C^2-4.33D^2。BL21(DE3)/pET-21b-hBD-2-haFGF的最优表达条件为:诱导温度39.52℃,IPTG浓度0.60 mmol/L,pH值7.95,时间3 h,预期灰度值为62.893。通过本研究可为进一步大量诱导制备、纯化hBD-2-haFGF蛋白提供技术支持。