碱性果胶裂解酶基因的克隆及核苷酸序列分析

以 p Bluescript KS(M13- )质粒作为载体构建嗜碱芽孢杆菌 NTT33的基因组文库 .在 YC平板上筛选到一株含果胶裂解酶 (pectate lyase,pel)基因的大肠杆菌阳性克隆子 .酶切后 ,电泳鉴定 ,插入的外源片段约 6 .5kb.通过引物步行法测定了含有该基因的约 3kb左右的外源 DNA片段的核苷酸序列 .经 PCgene软件分析发现第 15 0～ 116 0 bp编码一个由 337个氨基酸组成的蛋白质分子 .根据果胶裂解酶的等电点分类方法推断 ,其属于Pel A.将其与 Genebank中现有的基因编码的氨基酸序列进行同源比较 ,发现它与 Bacillus sp.Ksm SM- P15的Pel E和 Azospirillum irakense的 Pel A的同源性分别为 38%和 32 % .这 3种酶与其它果胶裂解酶的基因同源性很低 。

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白BGSP-2的序列进化分析、基因克隆及诱导表达

从实验构建的七鳃鳗口腔腺cDNA文库中获取BGSP-2(buccal gland secretion protein)基因片段,并对其进行生物信息学分析.RT-PCR扩增,已获得日本七鳃鳗口腔腺BGSP-2蛋白的全序列cDNA,将目的基因与pET23b载体连接,进一步转化至Rosetta表达菌株中,筛选阳性克隆,对包涵体进行变性、复性与纯化.结果显示已成功获得成分均一的活性蛋白.

猪白细胞介素-2在甲醇酵母中的表达

将猪白细胞介素-2(pIL-2)的完整cDNA序列克隆到甲醇酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC3 5K中,在E.coli体系中鉴定得到阳性克隆子pPIC3 5K-IL2。将pPIC3 5K-IL2经SacI线性化后,转化入经LiC1致敏的P.PastorisGS115菌株中,得到的重组菌株经1%浓度甲醇诱导后,利用SDS-PAGE电泳,斑点杂交及去糖基化酶消化证实,在培养上清中获得了分泌型表达的猪白细胞介素-2(蛋白分子量约为20KD),其表达量可达到80mg/L。用CTLL-2细胞进行活性检测,生物学活性可达2×106IU/ml。对其表达情况进行时间梯度分析,确定第5天表达量达到最高点,为最佳诱导时间;分析连续4个批次的重组菌株表达情况,结果表明重组菌株在适当菌体浓度下连续培养均能稳定、高效的表达外源蛋白pIL-2。本实验为进一步大规模生产pIL-2提供了理论依据。